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Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
IX CONGRESO NACIONAL DE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES
Volumen XVI - 2000 - pág 135 a 146.

TOXICIDAD EN VEGETALES: PROBLEMÁTICA Y ANÁLISIS
Casabuono, A. C. y Pomilio, A. B.*

* PROPLAME-CONICET, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires - 3 Piso, Pabellón II, Ciudad Universitaria, CP 1428 - Buenos Aires, Tel/Fax 54 11 4814 3952, e-mail: proplame@quimor.qo.fcen.uba.ar.

RESUMEN

Dado que en nuestro país el ganado se alimenta principalmente de pasturas naturales, muchas de las cuales le son nocivas, resulta importante una revisión y actualización de la información existente sobre estas intoxicaciones.

Uno de los proyectos de investigación del PROPLAME encara el estudio de especies vegetales tóxicas en forma integral, comprendiendo la identificación del material vegetal, seguimientos toxicológicos y el estudio estructural de los metabolitos secundarios.

La metodología de trabajo comienza con la identificación de la especie por botánicos especialistas y continúa con la extracción con solventes de distinta polaridad. Mediante el uso de diversos métodos separativos, principalmente técnicas cromatográficas, se aislan los metabolitos presentes. La caracterización e identificación de los principios activos se realiza por métodos electroforéticos y por espectroscopia UV, IR, RMN y CGL-EM entre otros.

El seguimiento de toxicidad se efectúa inyectando i.p. en ratones y luego se analizan histopatológicamente los órganos afectados por las fracciones y/o sustancias activas.

Así, se estudiaron en nuestro laboratorio especies pertenecientes a distintos géneros e incluso a distintas familias (Compositae, Solanaceae, Gramineae). Si bien en algunas especies las estructuras de los principios activos estaban correlacionados con la quimiotaxonomía de la familia en otras, como Poa huecú y Festuca argentina, ambas pertenecientes a la familia Gramineae, tribu Festuceae, estaría más relacionada con metabolitos que se generarían como respuesta a interacciones a nivel ecológico, involucradas en las asociaciones planta-endofito y animal-planta-endofito.

SUMMARY

In our country cattle grazing based on natural pastures leads sometimes to loxicoses, which require an up-to-date and continuous revision.

One of the research projects of PROPLAME deals with the full study of toxic plants of Argentina, including the botanical identification of the plant material, structure elucidation of the secondary metabolites and toxicological assays. The methodology begins with the identification of the botanical species by taxonomists, followed by the extraction of the plant material with solvents of different polarity. The constituents are isolated by the use of a variety of separative steps, especially an array of chromatographic techniques.

The identification of the active compounds is performed by chemical and spectral data, e.g. UV, FT-IR, 1H- and 13C-NMR, GC-MS, EI-MS, FAB-MS.

Toxicity and/or lethality of the chromatographic fractions and constituents are monitored by ip administration to mice, animáis are necropsied and the injured organs are subjected to a histopathologic analysis.

A number of especies belonging to different genera of families such as Compositae, Solanaceae, have been studied in our laboratory. Chemical structures of the active compounds usually are well correlated with chemotaxonomical viewpoints of the botanical family. However, in the case oíPoa and Festuca especies (family: Gramineae) the lethality could be explained as a response to ecological interactions involved in plant-endophyte and animal-plant-endophyte associations.

INTRODUCCIÓN

Dada la mortalidad observada en vacunos por ingestión de algunas pasturas naturales, resulta importante estudiar aquellas especies botánicas que perjudican en grado sumo a nuestra ganadería. Debe tenerse en cuenta que siendo nuestro país esencialmente agrícola-ganadero, y que la alimentación del ganado se efectúa principalmente por pasturas naturales, se estiman anualmente numerosas pérdidas o bien intoxicaciones graves de los animales, por no conocer los principios activos y por ende no contar con los antídotos adecuados.

Vale la pena destacar, que existe una marcada y constante demanda de información en esta área, especialmente por profesionales veterinarios que en la práctica diaria se ven enfrentados a diagnósticos presuntivos de intoxicaciones, que en la mayoría de los casos no pueden aclarar. Las causas más frecuentes son el desconocimiento de las especies reconocidas como tóxicas, el hecho de confundir especies botánicas y no poseer datos químicos de sus componentes, así como de sus principios activos y patogenia, y por último la falta de actualización y desarrollo de este tema en el país.

En el marco de nuestro laboratorio dentro del PROPLAME (Programa de Plantas Tóxicas y Medicinales, y Metabolismo de Sustancias Sintéticas y Naturales) se continúa encarando entre otros proyectos de investigación, el estudio de especies vegetales tóxicas de nuestro país, sobre las que no se conocían estudios químicos y toxicólogos sistemáticos sobre la relación toxicidad-identidad de la planta involucrada. En general, las plantas tóxicas se registran a nivel agronómico y/o botánico, y suele ocurrir que los lugareños las denominen con nombres vulgares que generan confusión ya que pueden comprender a varias especies del mismo y a veces distinto género. Por ello, en base a nuestra experiencia partimos de material vegetal identificado por taxónomos especialistas y, mediante el uso de técnicas extractivas y cromatográficas, realizamos el seguimiento toxicológico de fracciones y subfracciones en animales de experimentación hasta caracterizar e identificar el principio activo, por métodos químicos y aplicación de técnicas espectroscópicas (1H- y 13C-RMN mono- y bidimensionales, UV, IR, espectrometría de masa de impacto electrónico IE-EM y por bombardeo de átomos rápidos FAB-EM, etc.)

Así, se han elucidado en este laboratorio los principios activos de especies pertenecientes a distintos géneros provenientes de diferentes familias. En algunos casos, la estructura química del compuesto letal resultó concordante con las características quimiotaxonómicas del género o bien de la tribu. Sin embargo, en la tribu Festuceae la relación tóxico-metabolito secundario no sería tan directa, sino que podría ser comprensible tan sólo teniendo en cuenta aspectos ecológicos como las posibles interacciones animal superior-planta, planta-endofito, endofito-tóxico.

Breve descripción de algunos de los géneros y especies previamente estudiados en nuestro laboratorio (1):

WEDELIA (familia Compositae): Este género se caracterizó químicamente por poseer diterpenos tetracíclicos.

Wedelia glauca (Ort.) Hoffmann ex Hicken, de nombre vulgar "sunchillo", "yuyo sapo" ó "suncho", palabra quechua que significa arbusto de flores amarillas, es autóctona del centro y zonas irrigadas del noroeste de nuestro país. Es una especie invasora para la agricultura y resulta especialmente tóxica para bovinos que la comen sin reparos.

Wedelia buphthalmiflora Lorentz, reclasificada como Zexmenia buphthalmiflora (Lorentz) Ariza Espinar, crece frecuentemente en suelos rocosos del centro de la Argentina y es considerada venenosa por algunos autores.

SENECIO (familia Compositae) es un género que posee alrededor de doscientas cincuenta especies en Argentina (2). En un gran número de ellas se encontraron alcaloides pirrolizidínicos y furanoeremofilanos. Los alcaloides pirrolizidínicos son en general hepatotóxicos y responsables de "seneciosis" que causan pérdidas en el ganado.

Senecio crassifloms (Poir.) D. C. ó "boleo" es una hierba perenne de 30-40 em de altura que posee flores amarillas, endémica de las dunas del sur de Brasil, Uruguay y noreste de Argentina. Senecio bonariensis H. et A. ó "margarita de agua" es frecuente en zonas húmedas de Uruguay, noreste y centro de Argentina.

Senecio vira-vira Hieron, es común en las regiones secas del centro de Argentina (2).

DATURA L. (familia Solanaceae) es un género cosmopolita que ha sido usado desde la antigüedad con fines alucinógenos (3). Varias especies, como D. stramonium (en inglés: "jimson weed") son ingeridas voluntariamente por humanos ya que contienen alcaloides del tropano y, a dosis intermedias, producen alucinaciones, delirio y fiebre mientras que en dosis bajas se registran midriasis y palpitaciones, y por sobredosis depresión, paro cardíaco y respiratorio (4). Se conocen especies ricas en alcaloides derivados de la escopolamina y otras, como D. stramonium, en derivados de la hiosciamina. En nuestro país se han registrado pocos casos de intoxicación del ganado por estas pasturas ya que usualmente los animales no la ingieren por su sabor no agradable. En cambio, la ingestión de sus semillas causa mortandad en chanchos y aves de corral por encontrarse accidentalmente mezcladas con semillas comestibles como sorgo y girasol.

Datura ferox L. o "chamico" es una hierba anual de 50 cm de altura y flores blancas (5), adventicia en América, y es la más distribuida en el norte y centro de Argentina (6).

NIEREMBERGIA (familia Solanaceae)

Nierembergia hippomanica Miers ó "chuscho" está ampliamente distribuida en Argentina. En nuestro laboratorio se identificaron alcaloides del tropano (acción parasimpatolítica) y fenetilaminas (acción simpatomimética) (7), aunque ninguno de estos compuestos resultó responsable de la toxicidad de esta especie en vacas, ovejas, conejos y caballos.

FESTUCEAE (familia Gramineae; subfamilia Festucoideae) es una tribu que presenta géneros como Festuca, Poa, Bromus y Lolium vulgarmente conocidos como pastos. Varias gramíneas patagónicas son designadas con el nombre de "coirón"; los lugareños distinguen diversos coirones según su aspecto y propiedades, pero en realidad pertenecen a distintos géneros.

Años atrás, se suponía que los alcaloides presentes en varios miembros tóxicos de esta tribu, tales como Festuca arundinacea Schreb. y Lolium perenne L. estaban implicados en las enfermedades como "pie de festuca" y "tembleques" (en inglés: "staggers") (8) producidas por estas pasturas. Sin embargo no se reprodujo el síndrome al administrar perlolina o lolina y sus derivados en animales de laboratorio. Posteriormente se identificó el principio activo de L. perenne como el indol isoprénico lolitrem B (9). También se ha relacionado la toxicidad de estas especies con la presencia de endofitos fúngicos, aunque no están presentes en todos los casos (10).

El género Festuca comprende unas cien especies mesotérmicas distribuidas en todo el mundo; muchas de las cuales son forrajeras. En la Argentina existen unas veinticinco especies ubicadas en diversos sistemas montañosos, y sólo han sido sindicadas como tóxicas F. argentina, F. hieronymi y, tal vez, F. dissitiflora (11).

Poa huecu Par. ó "coirón blanco" es un pasto perenne tóxico que crece en la zona patagónica occidental (11). Produce la enfermedad "huecú" o "pataleta" que muestra una forma crónica (12) con desórdenes nerviosos, y otra aguda que comprende un primer período con temblores y contracciones musculares en cuello y patas y pelo erizado y un segundo período con lesiones en la conjuntiva, parálisis y posteriormente la muerte en ovejas, caballos y vacas. Se consideraba que esta toxicosis era causada por la infección fúngica presente en la planta, sin embargo (13) reprodujeron experimental mente la enfermedad en ovejas usando aparentemente material vegetal libre de endofito. Por primera vez en nuestro laboratorio se logró reproducir la toxicosis en animales de laboratorio.

Festuca hieronymi Hackel ó "aive" es una planta perenne densamente cespitosa, que habita en estepas graminosas, valles y faldas montañosas del noroeste argentino, entre los mil quinientos y tres mil quinientos metros sobre el nivel del mar (11).

A principios de siglo Rivas y Zanolli estudiaron una planta causante de la "tembladera" y comprobaron que tendría una acción dañina en equinos, ovinos, bovinos y caprinos; según Parodi podría tratarse de F. hieronymi (11). Además mencionaron la existencia de un hongo no identificado certeramente como así también ejemplares que no provocaban toxicidad. Festuca argentina (Speg.) Parodi, llamada vulgarmente "coirón", "c. negro", "c. grande", "c. falso", "c. del huecú", "c. duro" y "pampa grass". Esta especie había sido descripta inicialmente bajo el género Poa y luego fue transferida a Festuca. Es una planta perenne que forma matas espesas de 0,50 m a un metro de altura (11); se encuentra en estepas secas y en faldas de cerros en la zona preandina patagónica comprendida entre Catan-Lil (Pcia. de Neuquén) y Lago Argentino (Pcia. de Santa Cruz); reaparece formando la estepa graminosa que rodea al Golfo San Jorge, llegando hasta Puerto Deseado (14).

Desde principios de siglo se describe una enfermedad del ganado bajo los nombres de "pataleta", "chucho" ó "tembladera", "staggers", "loco" ó "huecú" que se produce por un coirón; es un desorden no infeccioso que afecta a caballos, vacunos y ovinos. La enfermedad se caracteriza por un debilitamiento, súbitas contracciones musculares, movimientos irregulares de la cabeza, rigidez de los miembros y parálisis motoras transitorias, acompañados por espasmos bajo excitación. Existe también un desarreglo de la visión y conjuntivitis. Por los síntomas y el área geográfica donde ocurría, se deduce que el coirón sería la F. argentina.

OBJETIVOS

En este artículo se expondrá la metodología general utilizada en el PROPLAME para estos estudios químicos de toxicidad en las especies arriba mencionadas, que abarca desde la identificación del material vegetal, hasta la caracterización de los principios activos. En particular, se ejemplificarán con mayor detalle las técnicas y procedimientos de seguimiento de toxicidad en Festuca argentina.

Se discutirán los resultados obtenidos en todas las especies nombradas, haciendo énfasis en la problemática de la tribu Festuceae, que involucraría aspectos de Química Ecológica (15) y relaciones fenéticas entre F. argentina y F. hieronymi (16).

MATERIALES Y MÉTODOS

En general, cuando se debieron subfraccionar los extractos de polaridad baja o mediana (extracto de éter de petróleo, extracto metanólico) para aislar el principio tóxico, se utilizaron principalmente técnicas cromatográficas que se describen a continuación:

a) Cromatografía en columna: Los rellenos utilizados fueron silicagel "H" (Merck), sephadex LH-20 (Sigma), alúmina neutra (Woelm), resina de intercambio Amberlite IRA-400 (forma HO) (Sigma). Las columnas de silicagel y las de alúmina fueron eluídas a mediana presión. Para las cromatografías rápidas en "columna seca" se emplearon embudos con placa filtrante de vidrio sinterizado, haciendo vacío al agregar el solvente.

Todos los solventes utilizados en las extracciones y en las cromatografías fueron previamente purificados en nuestro laboratorio.

b) Cromatografía en capa delgada (CCD): Para las cromatografías analíticas en capa delgada se utilizaron placas preparadas de silicagel G (Merck) de 250 m de espesor, cromatoplacas de silicagel -60 F254 (Merck), de fase reversa RP-18 (Merck), de alúmina F254 de 100 m de espesor y de celulosa F254 (Merck). También se usaron cromatoplacas de alta resolución (en inglés: HPTLC) de silicagel 60 F254.

Para las CCD preparativas, se preparó cada placa suspendiendo 30 g de silicagel G en 60 ml de agua destilada y luego se extendió sobre una placa metálica (20 cm x 20 cm). Se la dejó reposar por 24 hs a temperatura ambiente y posteriormente se la activó en estufa a 110-120C durante una hora.

Como revelador universal se empleó una mezcla de ácido sulfúrico-ácido acético (1:1) o iodo. También se reveló con luz ultravioleta (UV) de longitud de onda de 254 nm. Como reveladores específicos se utilizaron: para alcaloides, el reactivo de Dragendorff según Thies, Reuther, modificación de Vágujfalvi (17); para terpenos, anisaldehído 1 % en medio ácido; para compuestos fenólicos, FeCl, al 2% en etanol y, para compuestos esteroidales, el reactivo de Liebermann Burchard (18). En todos los casos, luego de rociar la placa con el revelador correspondiente, se la calentó a 105-110C durante dos a cinco minutos.

c) Cromatografías gas-líquido (CGL): Se utilizó para el análisis de fracciones relativamente volátiles con columnas empacadas o capilares y detección de ionización de llama (en inglés: FID) y nitrógeno como gas portador.

Para caracterizar compuestos presentes en trazas se efectuaron los CG-EM, es decir CGL en columna empacada acoplados a espectrometría de masas o CGL capilar-EM, en un cromatógrafo Hewlett Packard 5890A acoplado a un detector selectivo de masas 5970B ó en un VG TRIO-2 VG Mass Lab respectivamente.

d) Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR; en inglés: HPLC): En general se usó con fase estacionaria de fase reversa RP-18, tanto en columnas analíticas como semipreparativas y se llevaron a cabo en un equipo Waters 6000A o en un equipo KONIK 500B con detección por espectrofotometría UV de longitud de onda variable Waters 481.

En los casos en que se aisló el metabolito secundario, se identificó por combinación de información tales como puntos de fusión, poderes rotatorios, espectros de absorción ultravioleta (UV), espectros de absorción infrarroja (IR). Los espectros de masas (EM) se realizaron por introducción directa o luego de COL, ionizando por impacto electrónico en general a 70 eV. También se estudiaron los espectros de resonancia magnética nuclear protónica (1H-RMN) y los de carbono trece (13C-RMN) de alta resolución a 200,1 MHz y 50,3 MHz respectivamente, en un espectrómetro Bruker ACE-200.

Material vegetal: Todas las especies estudiadas fueron identificadas por botánicos especialistas y en cada caso un ejemplar fue depositado en un herbario de renombre internacional.

Por ejemplo, Festuca argentina (Speg.) Par. fue recolectada por el Ing. A. Soriano en la Estación Experimental del INTA de Río Mayo, Chubut, e identificada en el Instituto de Botánica Darwinion por la Dra. Elisa Nicora. Ejemplar de herbario N SI 28004 depositado en dicho Instituto.

Extracción del material vegetal: La planta entera, o bien parte de la misma, fue secada a 30C en estufa con circulación de aire y molida posteriormente en un molino Wiley modelo DE-5 (en los casos de presencia evidente de aceites esenciales que resultaran de interés, el material fresco fue cortado y sometido a un arrastre con vapor de agua).

El material molido fue extraído sucesivamente en Soxhlet con solventes de polaridad creciente. El remanente vegetal de algunas especies se extrajo con agua en batch y agitación: posteriormente se filtró y centrifugó y la solución sobrenadante fue liofilizada. Partiendo de planta entera de F. argentina se obtuvo luego de extraer con éter de petróleo (fracción 60-80 C), con metanol y posteriormente con agua, un extracto de éter de petróleo (1,6 % del peso seco), un extracto metanólico (6,7 % del peso seco) y un extracto acuoso (1,5 % del peso del remanente vegetal seco).

Fraccionamiento del extracto metanólico: Se disolvió este extracto en solventes adecuados, se agregó poliamida para columna previamente lavada sucesivamente con cloruro de metileno, agua y metanol, y se evaporaron los solventes. La pastilla resultante se sometió a percolaciones sucesivas con cloruro de metileno, agua y metanol; por evaporación de los solventes se obtuvieron los percolados de cloruro de metileno, acuoso y metanólico respectivamente.

Parte del extracto metanólico de F. argentina se trató con poliamida (masa extr: masa poliamida, 2:3) y siguiendo el procedimiento descripto se obtuvieron los percolado de cloruro de metileno (1,0 % relativo a planta seca), percolado acuoso (2,8 % rel. a planta seca), y percolado metanólico (2,3 % rel. a planta seca).

Búsqueda y separación de alcaloides: Ante la sospecha de presencia de compuestos nitrogenados, en general se efectuó una búsqueda sistemática de alcaloides sobre el extracto metanólico o alguno de sus percolados, para luego ensayar toxicidad en ratones.

Así ocurrió en el caso del extracto metanólico de F. argentina pues presentó varias manchas anaranjadas al revelar con el reactivo de Dragendorff (17) los cromatogramas (CCD) de alúmina. Para proceder al aislamiento y fraccionamiento a los mismos, se ensayó la búsqueda analítica de las condiciones adecuadas de pH para las extracciones. Así, se disolvió un gramo del extracto metanólico seco en ácido sulfúrico 1 N, filtrando el insoluble en ese medio.

Sobre esta solución acuosa ácida se realizaron extracciones con cloruro de metileno, descartándose esta fase orgánica. A continuación la fase acuosa acida se extrajo con cloruro de metileno, llevándola previamente a distintos pH, resultando convenientes pH= 8 y 11. con NH4OH y luego con Na2CO, sólido.

Ensayos toxicológicos

Preparación de las muestras: Se prepararon suspensiones acuosas de los respectivos extractos y/o fracciones. En los casos de muy difícil dispersión se agregaron algunas gotas de Tween 80; o bien las muestras fueron colocadas en un baño ultrasónico durante unos minutos para lograr suspensiones estables hasta una concentración máxima de 100 mg/ml. de agua, adecuada según la naturaleza del extracto y/o fracción.

Así, se ensayaron los extractos de éter de petróleo, metanólico y acuoso, así como los percolados de cloruro de metileno, acuoso y metanólico y las fracciones provenientes de la marcha de alcaloides de F. argentina.

Animales de experimentación: Se inyectaron intraperitonealmente (i.p.) cepas puras de ratones de ambos sexos. Se trabajó con lotes de ratones, utilizando además en cada caso animales control y blancos.

Histopatólogos especialistas realizaron las necropsias de los ratones inyectados, y el examen histopatológico de los órganos afectados.

En una etapa avanzada del aislamiento del principio activo, en algunos casos se inyectaron animales superiores.

Fraccionamiento del extracto acuoso de Festuca argentina: La suspensión acuosa proveniente de la extracción del marco vegetal con agua (batch, agitación, temperatura ambiente) se centrifugó a 2000 rpm hasta obtener una solución límpida. Se trabajó sobre este sobrenadante, luego de liofilizarlo, buscando los métodos de fraccionamiento de este extracto polar que fuesen adecuados desde el punto de vista toxicólogico.

Resultaron útiles las precipitaciones del extracto acuoso con solventes orgánicos. Se efectuaron ensayos toxicológicos en. ratones inoculando suspensiones de los precipitados obtenidos a distintas concentraciones y de la solución remanente, logrando localizar la fracción activa.

Dado lo útil que resultó este método separativo, por ser reproducible y permitir trabajar con grandes cantidades, se repitió el procedimiento para el subfraccionamiento con control toxicólogico. Técnicas de liofilización, diálisis con membranas de diversos cortes y técnicas electroforéticas nativas y bajo condiciones desnaturalizantes fueron utilizadas satisfactoriamente. De esta manera se determinó la naturaleza química de los componentes de la fracción letal de Festuca argentina, evidenciando su naturaleza glicoproteica por el método de Folin-Lowry, tinción con azul brillante de Coomassie y reactivo de ácido periódico-Schiff (PAS).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Utilizando esencialmente la metodología descripta, en nuestro laboratorio (1) se obtuvieron previamente los siguientes resultados:

En Wedelia glauca resultó letal la fracción más polar del extracto metanólico, siendo el compuesto responsable un diterpeno tetracíclico monoglicosidado, acilado y sulfatado, causante de paro respiratorio en ratones. Para elucidar su estructura fue necesario realizar reacciones de degradación e hidrólisis en medio ácido y básico, así como un análisis espectroscópico exhaustivo del compuesto y de sus productos de degradación (19).

En contraste, de W. buphthalmiflora reclasificada como Zexmenia buphthalmiflora, se identificaron saponinas triterpénicas (20), y diterpenos relacionados con los de W. glauca, pero sin presentar toxicidad en los ensayos en animales de laboratorio.

En Senecio bonariensis y S. vira-vira el extracto de éter de petróleo produjo mortandad animal debido a derivados de furanoeremofilanos. Además, en estas dos especies y en S. crassiflorus resultó letal el extracto metanólico identificándose alcaloides pirrolizidínicos como la senecionina, anacrotina (21) y los correspondientes derivados N-oxidados en el extracto metanólico de S. crassiflorus así como sesquiterpenos (22). La hepatotoxicidad provendría de metabolitos generales de naturaleza pirrólica con centros electrofílicos reactivos (23).

El único estudio previo de Datura ferox de nuestro país lo realizaron Coussio y colaboradores (24) con el objetivo de efectuar en esta especie la determinación cuantitativa por COL de alcaloides totales, y en particular, escopolamina, teniendo en cuenta factores de distribución geográfica, localización en las distintas partes de la planta, etc. Sin embargo, los otros alcaloides de semillas no fueron estudiados químicamente.

Debido a intoxicaciones de origen incierto registradas en animales de corral en la provincia de Buenos Aires, al analizar este problema encontramos que se debía a la ingestión de semillas de "chamico" (Datura ferox) mezcladas con las semillas utilizadas como alimento usual de estos animales. Por esa razón, se estudió en nuestro laboratorio la fracción letal que resultó estar constituida por alcaloides que fueron analizadas estructuralmente en detalle. Además de la escopolamina mayoritaria que ya se había descripto, se estudiaron por primera vez los restantes alcaloides presentes en las semillas de esta especie que crece en la Argentina, siendo identificados alcaloides del tropano como 30C-tigloiloxipropano (tigloiltropeína), apoescopolamina (apohioscina), los nuevos compuestos 7|3-hidroxi-6p-propeniloxi-30C-tropoiloxytropano y 3-fenilacetoxi-6|3,7|3-epoxitropano (3-fenilacetoxiescopina), trazas de 7p-hidroxi-6p-isovaleroiloxi-30C-tigloiloxitropano y el alcaloide pirrolidínico higrina, no se detectaron hiosciamina, nicotina ni N-óxidos del tropano en las muestras estudiadas (25).

Aunque la escopolamina y otras drogas relacionadas son importantes anestésicos y antiespasmódicos se han revisto sus propiedades al ser dada en forma transdermal, su toxicidad sobre el sistema nervioso central y su acción alergenica.

El principio letal de Nierembergia hippomanica se aisló en nuestro laboratorio del percolado acuoso del extracto metanólico, identificándose por IR, 1H y 13C-RMN, EM e hidrólisis básica como la pirrol-3-carbamidina (26). La hiperexcitabilidad y las convulsiones generadas al inocular ese compuesto en ratones sugeriría una acción sobre el sistema nervioso central.

Las tres especies estudiadas pertenecientes a la tribu Festuceae resultaron tóxicas en ratones y produjeron un cuadro clínico patológico similar, aunque químicamente presentaron algunas diferencias. Así, en Festuca hieronymi resultaron activos los percolados de cloruro de metileno y acuoso y el extracto acuoso. Por otro lado, en Poa huecu resultó letal en ratones sólo el extracto acuoso, del cual se identificó una glicoproteína letal rica en glucosa y manosa, y en aminoácidos como prolina, ácido glutámico y ácido aspártico (27).

Además, esta glicoproteína reprodujo la sintomatología de ovejas y vacas en ratones (27).

Mientras que en Poa huecu no se detectaron compuestos nitrogenados alcaloidales, excepto colina y acetilcolina, en Festuca argentina se caracterizaron en nuestro laboratorio alcaloides de la familia de la lolina en baja proporción. Luego de una separación sistemática de alcaloides a distintos pHs realizada sobre el extracto metanólico de Festuca argentina y posterior purificación por cromatografía en columna, se elucidaron las estructuras de lolina, N-metillolina, lolinina (N-acetillolina), N-formillolina y el nuevo compuesto A5-N-acetillolina. Además, se identificó el acetato de colina, previa precipitación como la correspondiente sal de Reinecke (28).

Durante muchos años hubo controversias sobre si los alcaloides de la lolina podían ser la causa de la toxicidad que presentaban algunas pasturas. Sin embargo cuando inoculamos en ratones las fracciones alcaloidales de Festuca argentina conteniendo los derivados de lolina, no reprodujeron la sintomatología, y sólo resultaron letales al ser inyectados en altas concentraciones en animales de experimentación pero no al administrarlo por vía oral (29,30), en forma análoga a lo observado en Festuca arundinacea (31).

Por otro lado, se realizaron estudios sobre pasturas teniendo en cuenta no sólo la identificación del material vegetal sino también detectando la presencia o no de endofitos y su naturaleza (32). De esta manera se comenzaron a hacer estadísticas y estudios teniendo presente el trío planta-endofito-toxicidad, lo que mejoró la calidad de las conclusiones. Por ejemplo se observó que aparentemente se correlacionaría la concentración de estos alcaloides en la planta (CDL: Concentración de Derivados de Lolina) con el grado de infestación (% endofito) en la planta tóxica durante una estación determinada (33,34), pero no se pudo establecer una simple relación entre la CDL y la FIE (frecuencia infección endofítica) en condiciones de pastoreo a largo plazo ya que podrían estar involucrados factores asociados con la influencia del animal en pastoreo sobre la respuesta de la planta, crecimiento del endofito, y metabolismo, así como factores ambientales.

Ahondando en las funciones que podrían tener estos alcaloides norpirrolizidínicos con puente etéreo y teniendo en cuenta los conceptos de química ecológica como ser las posibles interacciones del vegetal con otros sistemas y su forma de expresión en cuanto a metabolitos secundarios de la misma, se puso en evidencia que estos alcaloides de la lolina tendrían funciones más relacionadas con propiedades de defensa y resistencia a insectos de la Festuca infectada que con la toxicosis en sí (35).

El estudio toxicológico que realizáramos en Festuca argentina condujo a los percolados y extracto activo, observándose parálisis generalizada al inyectar dosis letales en ratones, así como midriasis y ataxia del tren posterior. Luego se realizó el fraccionamiento de estos extractos eligiendo en forma empírica los métodos separativos más adecuados para los fines toxicológicos, analizando la actividad de cada subfracción en ratones. De esta manera y con permanente seguimiento de la acción letal, necropsia de los animales y estudios histopatológicos se obtuvieron los compuestos responsables de la parálisis e incordinación motora. Precipitaciones con solventes, diálisis con membranas de diversos cortes, permeaciones en geles y liofilizaciones fueron usadas como etapas claves en la purificación. Resultados análogos fueron obtenidos con Festucas genéticamente relacionadas.

CONCLUSIONES

En algunas especies estudiadas en nuestro laboratorio como Wedelia glauca, Senecio bonariensis, Senecio vira-vira y Senecio crassiflorus y Datura ferox, las sustancias que resultaron ser los principios tóxicos correspondían a metabolitos secundarios con estructuras químicas, si bien nuevas en varios casos, esperables desde el punto de vista quimiotaxonómico a nivel de tribu y/o género.

En cambio, el análisis de las especies pertenecientes a los géneros Festuca y Poa de la tribu Festuceae, los resultados que obtuviéramos se interpretan mejor en base a los conceptos introducidos por la Química Ecológica. Actualmente podríamos plantear el análisis de la toxicidad de esta tribu como un proceso complejo ya que no involucraría simplemente una interacción de tipo planta-animal. La presenciado endofitos en las festucas sudamericanas reconocidas como tóxicas y su ausencia en las especies reconocidas como forrajeras (32), apoyaría en parte la hipótesis de que los endofitos fúngicos estarían relacionados de alguna manera con la toxicidad de estas plantas. Dado que el material vegetal empleado tenía endofitos, se generan varias interacciones y respuestas posibles a las mismas, como las referidas a si el endofito es el causante inmediato de la toxicidad, es decir, si éste generaría metabolitos letales para el ganado (micotoxinas), o si los mismos provendrían de la simbiosis mutualista.

Asimismo, otra posibilidad sería qe, a través de la asociación planta-microorganismo (gramínea-endofito) (36) se generara una respuesta de la planta de tipo fitoalexina que resultara tóxica al ganado, como por ejemplo el glicopéptido identificado en Poa huecu (27). Incluso se ha purificado del tejido de hojas de Poa ampla Merr. infectadas por endofito, una proteinasa de Acremonium typhinum que se expresa abundantemente en el pasto huésped infectado. Dado que esta proteinasa posee una expresión regulada en cultivo del hongo mientras que es abundante en tejido de planta infectada, se sugiere que su expresión podría estar involucrada con la interacción simbiótica planta-hongo (37).

Es por ello que ha resultado importante encarar las investigaciones en la tribu Festuceae y en general en gramíneas, hacia las interacciones planta-endofito-animal superior y los metabolitos relacionados desde un aspecto multidisciplinario bioquímico-micológico-biológico y químico para poder así clarificar las toxicosis provocadas por varias especies de esta familia.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y a la Universidad de Buenos Aires (UBA) por el apoyo financiero, como así también al Ing. A. Soriano, a la Dra E. Nicora y al Dr E. Zallochi por la recolección e identificación de parte del material vegetal.

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