TRABAJOS CIENTIFICOS
Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.
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Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
V JORNADAS NACIONALES DE ACTUALIZACIÓN SOBRE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES - San Carlos de Bariloche (Río Negro), Argentina - 1991
Volumen XII - 1994 - pág 313 a 326.CLONACIÓN DE TAXONES SELECTOS DE Artemisia dracunculus L. var. sativa POR CULTIVO IN VITRO
S. Sharry; A. Chamorro; W. Abedini y R Bezzus ** Centro Experimental de Propagación Vegetativa. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Universidad Nacional de La Plata. Diagonal 113 N°469 (¡900) La Plata, Provincia de Buenos Aires.
SUMMARY
A combination of 0,2 mg/liter kinetin with 2 % sucrose and 0,7 % agar produced the greatest number shoots from sterile stem pieces of French tarragon (Artemisia dracunculus L. var. sativa) placed on Linsmaier-Skoog (L.S) medium at 21° C ± 2° C and supplied with 8 hs. photoperiod from fluorescent lamp. At the end of 40 days in culture was obtained a total of 63 shoots for each explant. Results indicate that propagation in vitro would be an efficient way for rapid establishment of a desiderable line for commercial or home garden use.
Key words: Artemisia dracunculus, in vitro culture, micropropagation, clonation.
RESUMEN
Utilizando el medio de cultivo de Linsmaier-Skoog adicionado con 0,k2 mg/1 de cinetina, 2 % de sacarosa y 0,7 % de agar se produce una buena proliferación de yemas de Estragón francés (Artemisia dracunculus L. var. sativa) a partir de porciones de tallo colocadas a 21° C ∓ 2° C y con un fotoperíodo de 8 hs. Luego de 40 días en cultivo se obtuvieron 63 yemas por cada explanto. Los resultados indican que la micropropagación in vitro se muestra como una eficiente alternativa para una rápida clonación masiva de taxones selectos de Estragón francés de uso comercial.
INTRODUCCIÓN
La Artemisia dracunculus L. var. sativa, comúnmente conocida como "Estragón francés", es una hierba perenne utilizada como condimento y aromatizante para comidas. El alto precio de este producto lo presenta como una alternativa rentable de producción en la actualidad.
La zona típica de cultivo en la República Argentina se restringe a zonas áridas y semiáridas bajo riego del centro del país, aunque también existen antecedentes de su cultivo en la Provincia de Buenos Aires.
En la Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales se está desarrollando un programa de introducción y mantenimiento de distintas especies aromáticas y sus diferentes orígenes, entre las que se encuentra el Estragón francés. Este plan tiene como objetivo realizar estudios acerca de la posibilidad de cultivo masivo de estas plantas en diferentes zonas de la Provincia de Buenos Aires, para que la Facultad pueda aportar al productor el material vegetal selecto necesario para realizar plantaciones.
El Estragón francés se propaga agamicamente por división de matas, acodos, enraizamiento de estacas y micropropagación in vitro. Esta planta generalmente no florece y si lo hace, la producción de semilla viable es baja.
De todas las técnicas mencionadas, la micropropagación in vitro puede proveer una mayor cantidad de plantas madre selectas adaptadas a determinadas condiciones ambientales, en espacio reducido (laboratorio) y en menor tiempo, siendo la venta de estas plantas una operación rentable.
La Artemisia dracunculus responde satisfactoriamente al cultivo in vitro, como lo demuestran varios trabajos publicados al respecto. Podemos citar entre ellos el de Rggemans, J. (1980); Macklay, W. y Kitto, S.L. (1986, 1988) y el de Garland, P. y Stoltz, L. (1980).
El objetivo inicial del presente trabajo fue aplicar el protocolo de Garland y Stoltz (1980) para multiplicar masivamente clones de Estragón francés, producto de la selección realizada en el Campo Experimental de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales de la Universidad Nacional de La Plata.
Debido a que la respuesta al cultivo in vitro de los diferentes vegetales está íntimamente relacionada con su genotipo y ecotipo, la técnica inicial fue adaptada a nuestros clones, resultando un protocolo de cultivo diferente al de los autores citados.
MATERIALES Y MÉTODOS
La planta madre de 2 años de edad, fue seleccionada de cultivos establecidos en la Provincia de Córdoba y cultivada luego en el Campo Experimental de nuestra Facultad ubicada en la ciudad de La Plata, al NE de la Provincia de Buenos Aires, demostrando una buena adaptación a las condiciones ecológicas de esta zona. Se utilizaron como explanto secciones de tallos jóvenes de 1 a 2 cm de largo, desprovistos de hojas maduras, conservando sus yemas axilares y brotes, los que fueron recolectados durante las cuatro estaciones del año. Se probó también la respuesta de porciones de hojas maduras y tallos desprovistos de yemas. La técnica de desinfección usada fue la siguiente:
- Cepillado con agua y jabón blanco
- Inmersión en funguicida (Kptan 1500 ppm) durante 20 minutos
- Inmersión en etanol al 70 % durante 2 minutos
- Inmersión en bicloruro de mercurio al 2 % durante 2 minutos
- Inmersión en hipoclorito de sodio al 10 % durante 5 minutos
Los explantos así desinfectados se lavaron en solución de ácido cítrico al 5 ‰ bajo campana de flujo laminar. Posteriormente fueron sembrados en medio de aislamiento (Murashige-Skoog completo, 2 % de sacarosa, 0,7 % de agar, adicionado con 0,2 mg/l de 6-bencil-amino purina y 0,05 mg/l de ácido naftalen acético). Este medio de cultivo fue esterilizado en autoclave y su pH ajustado a 6,2. Se probaron otros medios de cultivo semisólidos y líquidos y otros balances hormonales. Los envase utilizados fueron tubos de ensayo de 250 mm x 12 mm, llevando cada uno 35 ml de medio de cultivo.
Al cabo de 7-10 días los explantos no contaminados fueron repicados a medio de proliferación (Linsmaier-Skoog completo, adicionado con 170 mg/l de monofosfato de sodio, 0,2 mg/l de cinetina, 2 % de sacarosa y 0,7 % de agar). En este caso fueron probadas, además, la 6-bencil amino purina (BAP) en diferentes proporciones.
Las condiciones ambientales del cultivo fueron logradas en una cámara climatizada a 21° C ∓ 2° C, con 16 hs. de oscuridad y 8 hs. de luz. Aproximadamente a los 15 días de cultivo son repicados nuevamente a medio fresco de proliferación con el objeto de inducir una mayor multiplicación de yemas.
Una vez que se obtiene una gran cantidad de brotes nuevos, se separan y pueden colocarse nuevamente en medio de proliferación para aumentar la tasa de multiplicación, o sembrarse en medio de enraizamiento (Medio de White adicionado con diferentes concentraciones de ácido indol butírico).
RESULTADOS
El explanto que presentó mejor respuesta fue la porción de tallo de 1-2 cm desprovista de hojas maduras pero conservando sus yemas y brotes pequeños, recolectados durante la primavera. Se observó que las porciones de hojas y tallos desprovistos de yemas no respondieron al cultivo in vitro.
Con respecto al método de desinfección del explanto, la técnica utilizada por Garland y Stoltz no dio buenos resultados con nuestro material, observándose un alto grado de contaminación con la misma. En cambio el protocolo de desinfección aplicado por nosotros hizo posible solucionar el problema de pérdidas de material por contaminación. La utilización de ácido cítrico como agente antioxidante dió buenos resultados, no observándose esta reacción en los explantos utilizados, excepto las porciones de hojas. La función del medio de aislamiento fue descartar los explantos contaminados y obtener una primera reacción del material al cultivo in vitro, que se manifestó con el alargamiento de las yemas existentes en el explanto. Se observó que en medios con concentraciones altas de auxinas, los explantos reaccionaban dando callo (tejido poco diferenciado). Al no ser ésta la respuesta buscada, estos medios se descartaron. Tampoco se obtuvo una buena proliferación utilizando medio de cultivo líquido. El medio de proliferación adicionado con 0,2 mg/l de cinetina es el que ofreció mejores resultados. Con BAP los brotes no presentaban un alargamiento que favoreciera su posterior separación del explanto original para su subcultivo.
La cantidad de yemas obtenidas por explanto al cabo de aproximadamente 45 días fue de 63, lo que teóricamente, nos permitiría obtener unas 1000 plantas por cada 16 explantos de tallos de 1-2 cm de largo. El pH del medio de cultivo influyó en la formación de hojas, observándose que el pH óptimo es 6,2. Actualmente los cultivos se encuentran en etapa de enraizamiento, observándose una respuesta favorable del material ensayado.
El tiempo de obtención de una planta completa, por esta técnica, se estima en 2 meses en cámara de cultivo y luego su rustificación a campo.
CONCLUSIONES
La micropropagación in vitro se presenta como una alternativa promisoria para la obtención de gran cantidad de plantas madre de Estragón francés que colmen las necesidades del productor de nuestra zona de influencia. El alto costo que representa la producción de plantas por esta técnica, lleva a que las mismas puedan ser utilizadas como plantas madres selectas, que luego deberán ser reproducidas vegetativamente con fines comerciales. De todas maneras, la alta tasa de propagación in vitro garantiza una provisión constante e importante de este material seleccionado.
Esta técnica puede ser aplicada a otras especies aromáticas de importancia económica para la obtención de plantas madre con el fin de lograr una gran cantidad de individuos selectos que se adapten a los diferentes sistemas de producción. Por este motivo la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales de la Universidad Nacional de La Plata continúa con este plan de propagación masiva de especies aromáticas con características productivas deseables.
Cabe agregar que las plantas que se obtengan por micropropagación serán evaluadas en sus características productivas: producción de materia verde, cantidad y calidad de esencia, susceptibilidad a enfermedades. Estas características estarían garantizadas por realizarse una clonación de fenotipos selectos a través de la micropropagación in vitro.
DISCUSIÓN
El trabajo de Garland y Stoltz (1980), tomado como modelo de protocolo de micropropagación de Estragón francés no se adecuó a los clones seleccionados con los que se trabajó. En este sentido, la desinfección utilizada por esos autores no fue suficiente para nuestro material, debiendo recurrir a otros agentes desinfectantes. Esto podría deberse a las diferentes condiciones ambientales en que fueron cultivadas las plantas, lo que lleva a que los agentes contaminantes y organismos patógenos sean particulares de cada zona.
La respuesta en el medio de aislamiento fue similar en ambas experiencias, pero la reacción de los explantos en el medio de proliferación fue bien diferente. En el trabajo modelo se utilizó como citocinina inductora de yemas a la 6-bencil amino purina, obteniendo buena proliferación. En nuestro cultivo con 6-BAP, esta proliferación fue mínima, presentando además brotes sin alargamiento y muy arrosetados, características poco deseables para la micropropagación in vitro. Por este motivo se usó la cinetina, dando la misma los resultados buscados (brotes con entrenudos normales y buenas hojas).
Los autores citados observaron formación de callo en región peciolar y porción distal de hojas. Esta reacción no fue observada en nuestros cultivos en balances favorables a las citocininas, lo cual representa una ventaja al obtener proliferación directa de yemas y la consecuente clonación de taxones selectos sin correr el riesgo de encontrar variabilidad por la antedicha formación de callos. Garland y Stoltz realizaron la subdivisión de yemas para su subcultivo cada 30 días, utilizando para nuestro trabajo un tiempo más corto (15-20 días) para dicha tarea, lo que permite reducir el lapso de producción de planta completa.
Inferimos que la diferente reacción de los cultivos a un mismo protocolo de micropagación se debe a que existen respuestas diferentes según el genotipo utilizado, coincidiendo esto con las observaciones realizadas por otros autores en distintos cultivos.
Respecto a los métodos clásicos de propagación por separación de matas, donde la tasa de multiplicación encontrada es de 5 plantas por cada planta madre, y durante la estación favorable, la utilización de la micropropagación por cultivo in vitro demuestran una amplia ventaja debido a que esta tasa es superada por la producción de 1000 plantas cada 30 cm de tallos, en condiciones de laboratorio y durante todo el año.
BIBLIOGRAFÍA CITADA
- Garland, P. and Stoltz, L. P., 1980. In vitro propagation Tarragon. HortScience 15(6):739.
- Linsmaier, E.M. and Skoog. 1965. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiol. Plan 18:100-126
- Mackay, WA. and Kitto, S.L..1986. Rapid propagation of Frenen tarragon ustng in vitro techniques. 22 International Horticultural Congress. Davis, CA(USA), 11-20 Aug.
- ------------, 1988. Factors affecting in vitro shoot proliferation of French tarragon. Journal of the American Society for Horticultural Science, v. 113 (2): 282-287.
- Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobáceo tisuue cultures. Physiol. Plant 15:474-497.
- Roggemans, J., Paulet, E., Boxus, P. and Brasseur, E., 1980. In vitro multiplication of tarragon (Artemisia dracunculus L.) Apex, meristem. Reunión EUCARPIA Section "Legumes", 78-Versailles (France), 16 Apr.
- White, P.R. The cultivation of and plant cells, 2nd ed. Ronald Press. New York.
TABLAS Y FOTOS
NUTRIENTES INORGÁNCOS (COMPOSICIÓN SALINA) DE DISTINTOS MEDIOS USADOS PARA CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS EN LA PRODUCCIÓN AGRONÓMICA
WHITE
MURASHIDE & SKOOG (MS)
LINSMAIER & SKOOG (LS)
Macro Nutrientes
mg/l
mM
mg/l
mM
mg/l
mM
NH4NO3
-
-
1650
20.6
1650
20.6
KNO3
80
0.79
1900
18.8
1900
18.8
Ca(NO3).4H2O
300
1.27
-
-
-
-
CACl2.2H2O
-
-
440
3.0
440
3.0
KCl
65
0.87
-
-
-
-
MgSO4.7H2O
720
2.92
370
1.50
370
1.50
Na2SO4
200
1.41
-
-
-
-
KH2PO4
-
-
170
1.25
170
1.25
NaH2PO4.H2O
16.5
0.12
-
-
-
-
Micro Nutrientes
mg/l
μM
mg/l
μM
mg/l
μM
KI
0.75
4.52
0.83
5.00
0.83
5.00
H3BO3
1.5
24.3
6.2
100
6.2
100
MnSO4.4H2O
7
31.4
22.3
100
22.3
100
ZNSO4.7H2O
3
10.4
8.6
29.9
8.6
29.9
NaMoO4.2H2O
-
-
0.25
1.0
0.25
1.0
CuSO4.5H2O
0.001
0.004
0.025
0.1
0.025
0.1
CoCl2.6H2O
-
-
0.025
0.1
0.025
0.1
Na2.EDTA
-
-
37.23
100
37.23
100
FeSO4.7H2O
-
-
27.95
100
27.95
100
Fe2(SO4)3
2.5
6.25
-
-
-
-
MoO3
0.0001
0.0007
-
-
-
-
pH
5,5
5,7
5,6
CLONACIÓN DE TAXONES SELECTOS DE Artemisia dracunculus L. var. sativa POR CULTIVO IN VITRO
FOTO 1 - Tipo de explanto, acondicionamiento del mismo. (C.E.PRO.VE, 1991).
EXPLANTOS DE Artemisia dracunculus L. var. sativa EN MEDIO DE AISLAMIETO (M.S. acondicionado con 0,01 ppm de ANA y 0,2 ppm de BAP)
FOTO 2 - De izquierda a derecha: explanto recién sembrado, a los 5 días y a los 10 días. (C.E.PRO.VE, 1991).
EXPLANTOS DE Artemisia dracunculus L. var. sativa EN MEDIO DE PROLIFERACIÓN
FOTO 3 - Nótese la gran cantidad de yemas nuevas formadas al cabo de 30 días de cultivo. (C.E.PRO.VE, 1991).
MEDIO DE PROLIFERACIÓN ACONDICIONADO CON 5 ppm de BAP
FOTO 4 - Las yemas formadas tienen entrenudos muy cortos y son arrosetadas. (C.E.PRO.VE, 1991)..
CALLO FORMADO EN UN MEDIO CON 2,5 ppm DE ANA Y 0,05 PPM DE BAP
FOTO 5 - (C.E.PRO.VE, 1991).
PROLIFERACIÓN DE YEMAS A LOS 45 DÍAS DE CULTIVO
FOTO 6 - Listas para ser repicadas a medio de enraizamiento. (C.E.PRO.VE, 1991).
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