TRABAJOS CIENTIFICOS Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.

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Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
V JORNADAS NACIONALES DE ACTUALIZACIÓN SOBRE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES - San Carlos de Bariloche (Río Negro), Argentina - 1991
Volumen XII - 1994 - pág 293 a 312.

USO DEL BIOENSAYO DE ARTEMIA SALINA PARA LA DETECCIÓN DE PRODUCTOS NATURALES CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LA FAMILIA Simarubaceae
Ricardo Furlan, Gustavo Molina, Osear Micheloni, Marta Zudenigo y Susana Zacchino *

* Farmacognosia, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Suipacha 531 (2000) Rosario.

RESUMEN

La búsqueda de bioactividad en muestras extraídas de especies de la Familia Simarubaceae usando como prueba el bioensayo de la letalidad de Artemia salina (1), detectó actividad biológica en los extractos etanólicos de Ailanthus altissima y de Quassia amara. La partición por solventes y cromatografía de los extractos totales monitoreados por el bioensayo, llevó al aislamiento del alcaloide β-carbolínico N-metoxi-1-vinil-δ-carbolina, como uno de los componentes bioactivos de las Q. amara. La elucidación estructural fue determinada usando ¹HRMN, IR, UV, ¹³CNMR Y H-H COSY.

ABSTRACT

Screening of extracts of different species from the Simarubaceae family using brine shrimp lethality as a bioassay (1), detected biological activity in the ethanol extracts of Q. amara and A. altissima. Solvent partitionings and chromatography, monitored by TLC and the brine shrimp assay, led to the isolation of N-methoxy-1-vinyl-β-carboline as one of the bioactive components. Structure elucidation was determined using ¹HMNR, IR, ¹³CMNR and H, H COSY.

INTRODUCCIÓN

La familia Simarubaceae comprende 20 géneros y 120 especies. Los géneros que se encuentran en nuestro país habitualmente son: Ailanthus, Castela y Quassia.

Especies de la familia Simarubaceae han sido extensamente estudiadas desde el punto de vista del aislamiento y la elucidación estructural de sus componentes encontrándose entre ellos principios amargos (2-6) y alcaloides (3-carbolínieos (7-15). Del género Ailanthus, la especie A. altissima se encuentra en nuestra ciudad y es utilizada como árbol ornamental en parques y zonas verdes de las grandes ciudades. De acuerdo con Dimitri y col. (16), esta especie confiere toxicidad al agua en contacto con ella. Esto constituye un peligro potencial dado el carácter público del emplazamiento de éstos árboles. Además sus hojas se han usado para adulterar la belladona y la menta, lo que agrega interés para estudiar su bioactividad.

Del género Quassia, el leño de la especie Q. amara tiene amplio uso en la medicina popular como eupéptico (17) y contra la pediculosis (18) y es ingrediente de bebidas aperitivas.

El género Castela ha sido usado en México y China para tratar la fiebre, disentería y amebiasis (17).

Estudios recientes de esta familia han recibido renovada atención por sus propiedades antimaláricas y antitumorales (5).

En nuestro continuo esfuerzo por descubrir y evaluar compuestos bioactivos de plantas, nosotros observamos que tanto el extracto de A. altissima como el de Q. amara eran activos en la prueba de letalidad de Artemia salina (19). El fraccionamiento de los extractos, monitoreado a través de bioensayo permitió aislar y caracterizar en la Q. amara un alcaloide (β-carbolínico responsable de la actividad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los extractos etanólicos totales de cada una de las partes de ambos pies de Ailanthus altissima, fueron probados con el bioensayo de Artemia salina obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla I para el pie masculino y en la tabla II para el pie femenino. Como se observa, únicamente el extracto de corteza de pie masculino resultó ser moderadamente tóxico para la Artemia (LC₅₀=728). Seleccionado el extracto activo éste se fraccionó según el esquema I y cada una de las fracciones se probó frente a la Artemia salina.

Los diferentes sub-extractos dieron los resultados que se muestran en la tabla III.

Como se observa, al contrario de lo que cabría esperar, la actividad va decreciendo a medida que se avanza en el fraccionamiento, por lo que no es posible determinar a través de este bioensayo los compuestos responsables de la actividad. Es posible que haya sinergismo entre los distintos tipos de compuestos, que se pierde al hacer el fraccionamiento.

El extracto etanólico total de Quassia amara probado frente al bioensayo, mostró una alta toxicidad frente a Artemia (Tabla IV). Dado que el leño de Q. amara contiene como todas las especies de la familia Simarubaceae, cuasinoides neutros (2) y alcaloides β-carbonílicos básicos (9), la partición del extracto total se realizó de acuerdo al esquema II.

Probamos actividad con las distintas fracciones etéreas obteniendo los resultados que se muestran en la tabla V.

Dado que sólo la fase que contenía alcaloides presentaba actividades, fraccionamos la misma por cromatografía en placa preparativa y posterior recromatografiado, obteniéndose 6 bandas las que, sometidas al bioensayo, dieron los siguientes resultados que se muestran en la tabla VI.

Las bandas 1 y 4 fueron inactivas.

La banda 2 (34.2 mg) mostró muy baja actividad, muy inferior a la del extracto total de alcaloides.

Se recromatografió cuatro veces en Hexano: Acetato de Etilo (40:60) obteniéndose cuatro fracciones de menos de 5 mg cada una, lo que era insuficiente para realizar el bioensayo. Es necesario recomenzar la extracción de Quassia amara desde el principio partiendo de mucha mayor cantidad de droga cruda.

La banda 3 (18 mg) con un LC₅₀ de 322 mostró por cromatografía en capa delgada ser un compuesto puro, Draggendorf (+).

Todos los datos espectroscópicos estaban de acuerdo con la estructura N-metoxi-1-vinil-β-carbolina (figura 1) que había sido reportada por Wagner y col. (8,9) como un alcaloide componente de la Quassia amara.

Su espectro ¹HRMN (200,13 MHz) (espectro 1a y 2b) mostró claramente:

1. El sistema ABX característico de un grupo vinilo (δ_A=7.72 ppm, δ _B=6.60 ppm, δ _X=5.65 ppm; J_{A, B}=17-1 Hz, J_AX=10.76 Hz, J_BX=2.00 Hz). En el espectro H,H COSY (espectro correlacionado en dos dimensiones) (espectro 2) se observa el acoplamiento de H_A con H_B y con H_X; de H_B con H_A y H_X y de H_X con H_A y H_B.

2. El sistema AB para los H₃ y H₄ δ₃= 8.49 ppm, δ₄= 7.84 ppm; J_3,4 = 5,14 Hz. Este acoplamiento se puede observar en el espectro 2.]

3. El sistema ABCD de los protones 5, 6, 7 y 8.

   Para analizar estos picos observamos el espectro ¹HRMN expendido (espectro 3) donde se pueden apreciar mejor los acoplamientos. El protón 5 aparece como δ=8.08 ppm; J_5,6= 7.8Hz. El doblete muestra picos anchos por el acoplamiento con H-7 (meta).

   Los H-6 y H-8 se encuentran ambos en el multiplete entre 7,56 y 7,63 ppm, H-6 se observa a δ=7.59 ppm y está acoplado con H-5 é H-8 (espectro 2) J_5,6 y J_6,7g=7.8Hz. Las dos señales centrales se superponen (ver diagrama en espectro 3). H-8 es un doblete a δ=7.61, J_7,8=5.96Hz. H-7 está acoplado con H-6, H-8 y H-5 (H,H COSY espectro 2), J_6,7=7.8Hz; J_7,8=5.96Hz; J_7,5=2.0Hz y por lo tanto a δ=7.31 ppm, se observa un multiplete de acuerdo con lo esperado (ver diagrama en el espectro 3).

4. Un singlete para tres protones a 4.02 ppm que se corresponde con un -OCH₃ aromático desprotegido con respecto a los δ de los -OCH₃ aromáticos unidos a carbono (δ=3.85-3.88 ppm) (20). Se puede esperar que este -OCH₃ esté unido al nitrógeno. Para confiar que no hay H unido al nitrógeno, se realizó el espectro IR de este compuesto, no encontrándose pico alrededor de 3300-3500 cm^-1 (espectro 4).

   El espectro de ₁₃CRMN desacoplado mostró una señal a 63.45 ppm característica del -OCH₃ y entre 110 y 140 ppm las señales de los carbonos aromáticos (espectro 5).

Los resultados obtenidos hasta el presente, concuerdan con los reportados por M. Munro y col (21) quienes demostraron que los alcaloides tipo β-carbolina que contienen un grupo vinilo en su molécula, presentan alta toxicidad.

Resta todavía realizar el análisis de las bandas 5 y 6. Ambas mostraron estar impuras por cromatografía en capa delgada y los espectros 1HRMN de ellas indican que no poseen protones aromáticos, por lo que no se puede esperar alcaloides tipo β-carbolínicos.

CONCLUSIÓN

El fraccionamiento dirigido por el bioensayo de la letalidad de Artemia salina, en especies de la familia Simarubaceae, llevó a la determinación que uno de los responsables de la actividad observada en el extracto total del leño de Quassia amara era un alcaloide conocido, el N-metoxi-1-vinil-β-carbolina. Su estructura fue confirmada por análisis espectroscópicos. La presencia del grupo vinilo, de acuerdo con los trabajos previos (21), sería muy importante para la toxicidad.

PARTE EXPERIMENTAL

PROCEDIMIENTOS GENERALES

Los espectros ¹HRMN y ¹³CRMN fueron realizados a 80.13 MHz (Bruker wp 80 sy) y a 200.13 MHz (Bruker AC 200E). Los espectros IR fueron realizados con un espectrómetro Bruker IFS 25 FT-IR. Los corrimientos químicos están dados en ppm y los valores de J en Hz. Las cromatografías preparativas fueron hechas en Sílica gel GF 254 y en capa delgada con cromatofolios de Merck (DC Alufolien).

MATERIAL VEGETAL

La corteza, hojas y flores de ambos pies de Ailanthus altissima fueron recogidos en el Parque Alem de la ciudad de Rosario. El leño de Quassia amara fue adquirido en Herboristería "La Riojana" Salta 3319, Rosario. Cada una de las muestras fue identificada por la cátedra de Botánica de la Fac. de Cs. Bioq. y Farmacéuticas (UNR) quedando una muestra depositada en el herbario de la misma.

EXTRACCIÓN DE Ailanthus Altissima

540 g de corteza, 1 kg de hojas y 450 g de flores del pie femenino; 600 g de corteza y 420 g de hojas de pie masculino perfectamente molidos fueron extraídos con etanol a reflujo (3x8 h).

Al extracto de la corteza de pie masculino (30.7 g) obtenido por filtración y evaporación del solvente, se le realizó el siguiente fraccionamiento: se agregó NH₃ aq. (pH=8-10) y Cl₃CH. La fase clorofórmica fue evaporada y el extracto particionado con HC1 aq. (pH=l-2). La emulsión resultante se separó con centrífuga refrigerada (CEFOBI-UNR) dando una fase clorofórmica (cuasinoides) y una fase acuosa acida (alcaloides). Por alcalinización con NH₃ aq. (pH=8-10) y extracción con Cl₃CH dio luego de la evaporación del solvente 76.7 mg de fase alcaloídica total.

EXTRACCIÓN DE Quassia amara

1 Kg de leño de Quassia amara molido hasta fragmentos pequeños, fue extraído con etanol a reflujo (3x8 h). El filtrado luego de concentrado en evaporador rotatorio dio 24 gr de un aceite marrón que fue particionado entre una solución acuosa de HC1 y éter etílico. La fase etérea fue concentrada al vacío dando 451 mg de extracto alcaloídico total.

Se cromatografió el extracto alcaloídico total por placa preparativa de sílica gel GF₂₅₄ con hexano: AcOEt (60:40) obteniéndose 6 fracciones de las cuales la de Rf 0.3 mostró una LC₅₀ de 322 frente a la Artemia salina.

Repurificando esta banda por cromatografía preparativa con el mismo solvente dio 18 mg de un compuesto puro, N-metoxi-l-vinil-β-carbolina ir √ cm^-1 2954, 2360, 1630, 1620, 1484, 1408, 1366, 1344, 1320, 1302,1178, 1154, 1094, 1050, 992, 948, 932, 826.

¹HRMN (CDCL₃) δ 4.02 (s, 3 H, OCH₃); 5,65 (dd, 1H, H-X, JBX = 2.00 Hz, J_AX=10.76); 6.60 (dd, 1 H, H-B, J_BX = 2.00 Hz, J_BA = 17.1 Hz);7.31 (m, 1 H, H-7, J_6,7 = 7.8 Hz, J_7,8 = 5.96 Hz, J_7,5 = 2.0 Hz); 7.59 (m, 1 H, H-6, J_6,5 = 7.8 Hz, J_6,7 = 7.8 Hz); 7.61 (d, í H, H-8, J_7,8= 596 Hz); 7.72 (dd, l H, H-A; J_AX = 10.76 Hz; J_AB = 17.1 Hz); 7.84 (d, 1 H, H-4, J_3,4 = 514 Hz); 8.08 (d ancho, 1 H, H-5, J_5,6 = 7.8Hz); 8.49 (d, 1 H, H-3, J_3,4 = 5.14 Hz).

¹³CRMN (CDC1₃) δ 63.45 (OCH₃); 109.23 (C-8); 113.81 (C-4); 118.24 (C-4a); 119.25 (C-R-2); 120.91 (C-7); 121.62 (C-5); 127.30 (C-4b); 128.79 (C-6); 130.7 (C-8b);131.31 (C-R-1); 138.40 (C-8a); 139.30 (C-1); 140.14 (C-3).

1. NACIMIENTO DE LAS LARVAS

   Huevos de A. salina (adquiridos en Veterinaria Pasco, Pasco 1474, Rosario) fueron colocados en una cuba rectangular (22 x 32 cm) llena con H₂O destilada. Una placa con varios agujeros de 2 mm de diámetro divide la cuba en dos compartimientos desiguales. Los huevos (50 mg) se echan en el compartimiento más grande que está oscuro mientras que el compartimiento más pequeño está iluminado. Después de 48 h las larvas que han migrado buscando la luz, se extraen con pipeta (descartable) del lado iluminado.

2. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

   Se prepara una solución madre (A) del compuesto o extracto a ensayar en metanol (proporción 50 mg en 5 ml). La solución B se prepara diluyendo 0.5 ml de A a 10 ml con metanol.

   Cantidades apropiadas de solución (100 μl de B, 50 μl de A y 500 μl de A para 10, 100, 1000 μl / ml respectivamente) son transferidas a discos de papel de filtro, se secan al aire y en corriente de N2 y se colocan en los viales para realizar el bioensayo.

3. BIOENSAYO

   10 larvas se transfieren a cada vial (triplicado para cada dosis) con una pipeta plástica descartable y se agrega agua de mar artificial hasta 5 ml. Los viales se mantienen bajo iluminación.

   Los sobrevivientes son contados a las 24 h con ayuda de una lupa, y el % de muertes en cada dosis se calcula como un promedio.

4. DETERMINACIÓN DE LC₅₀

   El valor de LC₅₀ es determinado usando el método estadístico descripto por Finney (3).

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Manuel González Sierra (IQUIOS, CONICET-UNR) por los espectros 1HRMN 200.13 MHz.

Al Dr. Claudio Salomón por los espectros JHRMN a 80.13 MHz (IQUIOS).

Al licenciado Carlos Boschetti por los espectros IR (IQUIOS).

Al CEFOBI (CONICET-UNR) por la centrífuga refrigerada.

BIBLIOGRAFÍA

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TABLAS, ESQUEMAS, FIGURAS, ESPECTROS

TABLA I - RESULTADOS PARA EL PIE MASCULINO
Número de sobrevivientes

PARTE USADA	10 μg/ml	100 μg/ml	1000 μg/ml	LC50 (μg/ml)
Hojas	10,00	9,65	7,33	>1000
Corteza	10,00	9,66	3,84	728

TABLA II - RESULTADOS PARA EL PIE FEMENINO
Número de sobrevivientes

PARTE USADA	10 μg/ml	100 μg/ml	1000 μg/ml	LC50 (μg/ml)
Hojas	10,00	10,00	10,00	>1000
Corteza	10,00	9,66	9,00	>1000
Flores	10,00	10,00	9,66	>1000

TABLA III - RESULTADOS DE LOS SUB-EXTRACTOS DE A. altissima
Número de sobrevivientes

Fases	10 μg/ml	100 μg/ml	1000 μg/ml	LC50 (μg/ml)
Clorofórmica I	10,00	10,00	4,66	961
Clorofórmica II	10,00	10,00	9,33	>1000
Clorofórmica III	9,66	8,57	5,00	964
Acuosa alcalina I	10,00	10,00	10,00	>1000
Acuosa alcalina II	10,00	10,00	10,00	>1000

TABLA IV - RESULTADOS DE LOS SUB-EXTRACTOS DE Quassia amara
Número de sobrevivientes

Parte usada	10 μg/ml	100 μg/ml	1000 μg/ml	LC50 (μg/ml)
Clorofórmica I	10,00	7,66	0,03	166

TABLA V - RESULTADOS DE LOS SUB-EXTRACTOS DE Quassia amara
Número de sobrevivientes

Fase	10 μg/ml	100 μg/ml	500 μg/ml	1000 μg/ml	LC50 (μg/ml)
c/cuasinoides	10,00	10,00	9,67	8,33	>1000
c/alcaloides	10,00	6,33	3,66	0	219

TABLA VI - RESULTADOS DE LAS FRACCIONES ALCALOIDICAS
Número de sobrevivientes

Fases	10 μg/ml	100 μg/ml	1000 μg/ml	LC50 (μg/ml)
Banda 1	10,00	10,00	8,33	>1000
Banda 2	10,00	10,00	4,00	790
Banda 3	9,33	9,33	1,50	322
Banda 4	10,00	9,00	8,00	>1000
Banda 5	10,00	4,33	0	87
Banda 6	10,00	9,00	2,00	388

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