TRABAJOS CIENTIFICOS Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.

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Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
V JORNADAS NACIONALES DE ACTUALIZACIÓN SOBRE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES - San Carlos de Bariloche (Río Negro), Argentina - 1991
Volumen XII - 1994 - pág 243 a 248.

AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE FITOPROTEASAS DE FRUTOS DE Maclura pomifera (RAF.) SCHNEED. (MORACEAE) Y DE Bromelia hieronymi MEZ (BROMELIACEAE)
C. L. Natalucci * N. S. Priolo, L. M. I. López ** M. C. Arribére *** y N. O. Caffini

* Miembro de la Carrera del Investigador de la CICPBA
** Becaria del CONICET
** Becaria de la Universidad Nacional de la Plata.
Laboratorio de Botánica Aplicada, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, Casilla 711, 1900, La Plata, Argentina.

RESUMEN

Las enzimas proleolíticas obtenidas a partir del látex de frutos de Maclura pomifera presentan máxima actividad en medio alcalino (80% del total entre pH 8,75 y 10,6), pueden almacenarse liofilizadas y son muy termoestables. Por precipitación acetónica y cromatografía de intercambio iónico se obtienen cuatro fracciones activas de Mr cercanos (63,8-72, 4kD), homogéneas por SDS-PAGE.

Por su parte, las proteasas provenientes de frutos de Bromelia hieronymi presentan máxima actividad proteolítica (90% del total) entre pH 7,2 y 10,0, moderada estabilidad térmica y se conservan inalteradas por liofilización. Mediante diafiltración y cromatografía de intercambio iónico se purifican cuatro formas moleculares de Mr próximos (26,1-28,6kD), homogéneas por SDS-PAGE.

INTRODUCCIÓN

Las proteasas ocupan holgadamente el primer lugar en el mercado mundial de enzimas¹, debido en buena parte a la variedad de aplicaciones que han demostrado poseer². En el campo de la Farmacoterapia las enzimas proteolíticas de origen vegetal son tradicionalmente empleadas como agentes antiinflamatorios³.

En el presente trabajo se dan a conocer los resultados obtenidos en el aislamiento y caracterización de las enzimas proteoliticas presentes en el látex de frutos de Madura pomífera y en los frutos inmaduros de Bromelia hieronymi. En una etapa posterior estas nuevas proteasas podrán ser ensayadas en cuanto a su potencial actividad antiiflamatoria y su efecto sobre la absorción medicamentosa.

MATERIAL VEGETAL

Maclura pomifera (Raf) Schneid. (Moraceae) es un árbol o arbusto dioico, espinoso, de hojas caedizas, aovadas, acuminadas, pubescentes en la foliación y posteriormente glabras, enteras, de 5 a 10 cm de largo. Las flores masculinas son blanquecinas, dispuestas en racimos fasciculados, mientras que las femeninas son sésiles, reunidas en capítulos esféricos, compactos. El fruto es un sincarpio globoso, verde o amarillo, de 10 a 15 cm de diámetro, formado por la concrescencia de múltiples y pequeñas drupas. Es una especie originaria de América Boreal ampliamente cultivada en toda la región templado-cálida de Argentina. Florece en primavera y madura en verano y otoño, multiplicándose por semillas⁴.

Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae) es una planta estolonífera que forma matorrales y posee filodios enhiestos glaucos, de punta prolongada y a veces esclerosada, con bordes armados de aguijones oscuros y curvos. Las flores, de 4 a 6 cm de largo, están ubicadas en las axilas de pequeñas brácteas, formando grandes panojas terminales, glabras y purpúreas. Los frutos son bayas fusiformes y fibrosas de unos 5 cm de largo por 2 cm de diámetro. Se extiende desde Paraguay, por Bolivia, hasta Argentina, en los campos con vegetación xerófila de Jujuy, Salta, Tucumán, Santiago del Estero y Chaco⁵.

PARTE EXPERIMENTAL

• Obtención de las preparaciones enzimáticas crudas y acondicionamiento de las mismas para ser purificadas por intercambio iónico

  Mediante incisiones superficiales de los frutos maduros de Maclura pomifera se logra obtener un jugo lechoso con intensa actividad proteolítica. El látex se recoge sobre buffer fosfatos 0,1 M de pH 7 y se centrifuga a 16000 x g durante 30 minutos; el sobrenadante constituye el extracto crudo, el que luego es precipitado con dos volúmenes de acetona. El precipitado obtenido es redisuelto en buffer Tris-ClH 50 mM de pH 8.

  Los frutos verdes de Bromelia hieronymi se trituran en presencia de acetona fría (-20°C). El polvo acetónico así obtenido se extrae con una solución buffer de fosfatos 0,1 M de pH 7, conteniendo EDTA y cisteína 50 mM. Por centrifugación a 16.000 x g se separa una solución que constituye la enzima cruda. A través de diafiltración se logra eliminar una gran cantidad de impurezas de bajo peso molecular.

• Determinación de la actividad caseinolítica

  La mezcla de reacción consiste en 1,1 ml de solución de caseína al 1 % y 0,1 mi de solución de enzima, ambas en buffer fosfatos 0,1 M (pH 7,0).

  Al cabo de 5 minutos a 37°C, se detiene la reacción mediante la adición de 1,8 ml de ácido tricloroacético (5 %). Las mezclas resultantes se centrifugan directamente en los tubos de ensayo donde se practica la reacción y los productos de hidrólisis se estiman por la lectura de la absorbancia de los sobrenadantes límpidos a 280 nm.

  Se adopta una unidad enzimática arbitraria (unidad caseinolítica) definida como la cantidad de enzima que produce una variación de una unidad de absorbancia por minuto en las condiciones antes mencionadas.

• Determinación de la concentración de proteínas

  Se utiliza el método de Bradford⁶, que mide la absorción a 595 nm del complejo formado entre la proteína y el colorante Coomassie Brilliant Blue G-250, usando albúmina bovina como patrón. En los eluatos cromatográficos la concentración de proteínas se estima por medida directa de la absorbancia a 280 nm.

• Estabilidad térmica del extracto crudo

  Muestras de extracto crudo se incuban a 37°C, 45°C, 55°C, 60°C y 65°C, durante 0, 5, 12, 25, 40, 60, 90 y 120 minutos; luego se colocan en baño hielo-agua hasta el momento del agregado del sustrato para la determinación de la actividad caseinolítica residual en la forma habitual (a 37°C).

• Variación de la actividad caseinoíítica en función del pH

  Para obtener el perfil de pH se utilizan soluciones de caseína al 1% preparadas en buffer fosfatos 0,1 M (pH 6,0-7,5), ácido bórico-cloruro de sodio-hidróxido de sodio 0,1 M (pH 8,0-10,0) y glicina-cloruro de sodio-hidróxido de sodio 0,25 M (pH 10,5-12,0). En todos los casos se determina la actividad caseinolítica en las condiciones antes mencionadas, a excepción de pH del buffer en el que se disuelve la caseína.

• Cromatografía de intercambio aniónico

  Se utiliza una columna (Pharmacia K 15/30) rellena con DEAE-Sepharose CL-6B, equilibrada con buffer Tris-HCl 0,05 M (pH 8,0) en la que se siembra la solución de enzimas a purificar. Luego de lavar la columna con un volumen de buffer de partida, las proteínas retenidas se eluyen con 200 ml de un gradiente lineal de cloruro de sodio (0,0-0,5 M) en Tris-HC 1 0,05 M (pH 8,0) para la muestra proveniente del látex de Maclura pomifera; en el caso de la muestra de Bromelia hieronymi el gradiente lineal aplicado fue 0,2-0,6 M de cloruro de sodio en el mismo buffer.

• Cromatografía de intercambio catiónico

  Las fracciones no retenidas por el intercambiador aniónico se aplican a una columna de iguales características, rellena con un intercambiador catiónico (CM-Sepharose CL-6B) y equilibrada con buffer Tris-HCl 0,05 M (pH 8,0). Luego de lavar la columna con 60 ml de buffer de partida, en el caso de la muestra de Maclura pomifera la elución fue llevado a cabo con 200ml de un gradiente lineal de cloruro de sodio (0,0-0,5 M) en el mismo buffer. El gradiente aplicado para Bromelia hieronymi fue 0,0-1,0 M en Tris-HCl 0,05M (pH 8,0).

• Electroforesis en geles de poliacrilamida conteniendo SDS

  Cada fracción separada por intercambio iónico se somete a electroforesis según el método de Laemmli ⁷, empleando geles al 10% para las obtenidas a partir de Maclura pomifera y al 12% para las correspondientes a Bromelia hieronymi. A los efectos de estimar el PM de las bandas obtenidas se siembran patrones de bajo PM (α-lactalbúmina, PM 14.400; inhibidor de tripsina, PM 20.100; anhidrasa carbónica, PM 30.000; ovoalbúmina, PM 43.000; albúmina de suero bovino, PM 67.000 y fosforilasa b, PM 94.000).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Por cada 100 g de frutos frescos de Maclura pomifera se obtiene un promedio de 0,5 ml de látex. El agregado de EDTA y/o cisteína al buffer extractante no modifica la actividad caseinolítica del extracto crudo, ni tampoco se incrementa la actividad enzimática por la adición de cisteína a la mezcla de reacción; en cambio utilizando PMSF 1mM se logra inhibir irreversible y completamente la actividad caseinolítica, lo que sugiere la naturaleza serínica de estas proteasas.

En cuanto a los frutos de Bromelia hieronymi, tal como ocurre en otras Bromeliaceae, contienen proteinasas cisteínicas, ya que se inactivan reversiblemente con cloruro mercúrico y p-hidroximercuribenzoato mientras que la cisteína y otros reductores actúan como activadores. El extracto crudo de ambas especies puede almacenarse liofilizado sin pérdida significativa de actividad enzimática.

El perfil de pH del extracto crudo muestra un comportamiento similar en ambos casos, ya que las enzimas son activas en la zona neutra y alcalina. Sin embargo las proteasas de Bromelia hieronymi exhiben más del 90 % de la actividad máxima en un muy amplio rango de pH (7,2-10.0), mientras que en las de Maclura pomifera el rango es más estrecho (la actividad máxima supera el 80 % entre pH 8,75 y 10.60).

La estabilidad térmica de las enzimas no purificadas es notable en el caso de Maclura pomifera: la actividad proteolítica se mantiene prácticamente sin variantes luego de incubarlas durante dos horas a 37°C y solo desciende un 12 % a 55° C durante el mismo tiempo. En Bromelia hieronymi, si bien la actividad no es afectada por dos horas de incubación a 37° C, se reduce en un 25 % a 45° C y a 55° C presenta solo un 35 % de actividad residual.

A partir de la muestra de Maclura pomifera se logran purificar cuatro fracciones proteolíticamente activas. Las fracciones I y II se obtienen a través de cromatografía de intercambio amónico, eluyendo con NaCl 0,10 y 0,17 M, respectivamente. Las restantes (fracciones III y IV) se separan sometiendo a las proteínas no retenidas en la primera etapa a cromatografía de intercambio catiónico y eluyen con NaCl 0,22 y 0,31 M, respectivamente. Estas fracciones se muestran homogéneas por SDS-PAGE. Por este método se calcularon sus Mr (64.000 y 72.000 para las dos primeras y de 71.000 para las dos últimas).

En el caso de Bromelia hieronymi también se obtienen cuatro fracciones con actividad proteolítica, tres de ellas (I, II y III) eluyen de DEAE-Sepharose cuando el gradiente aplicado es 0,24; 0,32 y 0,39 M. La fracción principal (IV) proviene de la aplicación de la fracción básica, no retenida por el intercambiador amónico, a una columna de CM-Sepharose de la que eluye cuando la concentración de NaCl es 0,4 M. Las cuatro fracciones son homogéneas por electroforesis en geles de poliacrilamida conteniendo SDS, calculándose los Mr de las fracciones I, II, III y IV en 29.000, 26.000, 26.500 y 28.000, respectivamente.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Mantell, S. H., J. A. Matthews y R. A. Me Kee (1985) "Principies of Plant Biotechnology. An Introduction to Genetic Engineering in Plants". Blackwell Sci. Pub., London, págs. 207-12.
2. Caffini, N. O., L. M. I. López, C. L. Natalucci y N. S. Priolo (1988) Acta Farm. Bonaerense 7: 195-213.
3. Kumakura, S., M. Yamashita y S. Tsurufuji (1988) Eur. J. Pharmacol. 150: 295-302.
4. Dimitri, M. J. (1978) "Moraceas", en "Enciclopedia Argentina de Agricultura y Jardinería" (M.J. Dimitri, dir.), Editorial Acme SACI, Buenos Aires, 3a Ed., Tomo I, Primer Volumen, pág. 327.
5. Castellanos, A. (1945) "Bromeliaceae", en "Genera et Species Plantarum Argentinarum" (H.R. Descollé, dir), Tomo III, pág. 151
6. Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-54.
7. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227: 680-5.

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