TRABAJOS CIENTIFICOS
Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.
|
|
| |
Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
V JORNADAS NACIONALES DE ACTUALIZACIÓN SOBRE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES - San Carlos de Bariloche (Río Negro), Argentina - 1991
Volumen XII - 1994 - pág 93 a 99.CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA LIPOLITICO PRESENTE EN SEMILLAS DE GIRASOL (Helianthus annuus L., Compositae)
Arribére, M.C., N.S. Friólo y N.O. Caffini ** Laboratorio de Botánica Aplicada, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, CC 711, La Plata, Argentina.
RESUMEN
Se cultivaron semillas de girasol (Helianthus annuus L., cv ACA 871) en la oscuridad sobre papel húmedo a 30°C. Al cabo de siete días el contenido residual de lípidos totales desciende al 20% del valor inicial. La mayor velocidad de degradación de los triacilglicéridos de reserva coincide (días 2 y 3) con el incremento de la actividad lipásica, que muestra dos máximos, a pH 3,7 y 8,5. La actividad lipolítica es recuperada en su totalidad en la capa grasa que se separa al centrifugar los homogenatos a 11.000 g durante 30 minutos y el perfil de pH de la misma es equivalente al de éstos.
INTRODUCCIÓN
Las lipasas son las enzimas responsables de la etapa inicial de la degradación (movilización) de los aceites de reserva durante la germinación de las semillas, con producción de glicerol y ácidos grasos, que son convertidos mayoritariamente en azúcares simples a través del proceso de gluconeogénesis 1.
En cuanto a su campo de aplicación, las lipasas son utilizadas por las industrias alimentaria, química, farmacéutica, cosmética, del cuero y de los detergentes, entre otras2. En la mayoría de los casos las enzimas utilizadas son de origen fungico3; sin embargo, trabajos recientes recomiendan tratar de obtener lipasas de plantas superiores, ya que se encuentran presentes en todas las semillas y en muchas de ellas en cantidades que justifican su explotación4.
No obstante, es aún escaso el número de especies en cuyas semillas se ha determinado la presencia de lipasas y muy reducidos los casos en los que dichas enzimas han sido purificadas y caracterizadas1. Huang y Moreau5 son los primeros en señalar la presencia de actividad lipolítica en plántulas de cuatro días de Helianthus annuus L. a pH 5, 7 y 9 utilizado N-metilindoxihniristato como sustrato. En un estudio posterior Fusseder y Theimer6 comprueban la existencia de una monoacilglicerolhidrolasa activa sobre el mismo sustrato a pH 8,5 en semillas en maduración (30 días posteriores a la antesis). Más recientemente, un intento fallido de aislar la lipasa responsable de la movilización de las reservas lipídicas de semillas de girasol permitió el aislamiento y caracterización de un inhibidor de lipasas, una proteína de peso molecular cercano a los 70 kD7.
En el presente trabajo se ha estudiado la relación entre la disminución del contenido de lípidos durante la germinación de semillas de Helianthus annuus L. y la aparición de actividad lipolítica, incluyendo una caracterización preliminar del sistema enzimático frente a su sustrato endógeno, como etapa preliminar del aislamiento y purificación de las enzimas que lo componen.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal
Semillas de girasol (Helianthus annuus L., cv. ACA 871), provistas por la Asociación de Cooperativas Argentinas C.L., Pergamino, Pcia. de Buenos Aires, Argentina.
Pretratamiento y germinación de las semillas
Las semillas se lavan con agua en forma continua durante 24 horas, al cabo de las cuales se colocan sobre toallas de papel húmedas y se ponen a germinar en la oscuridad, a 25°C y 30°C. El fin del período de imbibición fue considerado como día cero de la germinación.
Obtención de las muestras
Los ensayos para determinar la presencia de actividad lipolítica se llevaron a cabo sobre homogenatos de semillas en dormancia y en distintos estadios de germinación. Los cotiledones, seleccionados tanto por edad como por el tamaño del hipocótilo, fueron separados manualmente y homogeneizados en un medio Tris-HCl 0,1 M de pH 7,5 (2 ml de buffer por gramo de cotiledones frescos) en baño de hielo, durante un minuto. Cada homogenato fue filtrado a través de una tela de nylon (20 mallas por cm) y congelado inmediatamente hasta el momento de ser usado.
Centrifugando el homogenato a 11.000 g (4°C) se obtiene una capa grasa superior, un sobrenadante y un pellet, que se someten al análisis de actividad lipolítica.
Determinación del contenido de lípidos totales
Cotiledones obtenidos como se indicó en el punto anterior fueron homogeneizados con una mezcla cloroformo-metanol (2:1), utilizando 17 ml de mezcla por gramo de cotiledones frescos. La suspensión fue filtrada a través de papel de filtro y el residuo lavado dos veces con 2 ml de mezcla extractante por gramo de cotiledones8. Los filtrados fueron mezclados y evaporados con corriente de aire caliente hasta peso constante.
Determinación de azúcares solubles
Los cotiledones fueron desengrasados previamente con cloroformo y el residuo fue extraído en un erlenmeyer con tapa con etanol de 80° durante 10 minutos, con agitación permanente9. Para la determinación de glúcidos en los extractivos etanólicos se utilizó el método del fenol-sulfúrico10.
Determinación de la actividad lipolítica
La actividad lipolítica se determinó por un método colorimétrico11 en el que los ácidos grasos liberados en la lipólisis son convertidos en complejos de cobre que se solubilizan en isooctanato cuya absorbancia se determina a 715 nm.
El medio de reacción contiene 3 ml de solución buffer, 5 ml de isooctano y 3 ml de homogenato, agregados en ese orden. La reacción se lleva a cabo en un equipo "ad hoc"12, a 37°C durante 10 minutos y comienza con el agregado del homogenato, que contiene tanto la enzima como el sustrato (aceites propios de la semilla). La actividad enzimática se detiene por la adición de 3 ml de ácido clorhídrico 6 M y la mezcla se sigue agitando durante un minuto.
Finalmente se separan 3 ml de la capa superior de isooctano, que contienen los ácidos grasos liberados, y se hace reaccionar con 0,6 ml de solución de acetato de cobre al 5% llevada a pH 6,1 con piridina. Se agita cada tubo 90 segundos y se determina la concentración de los ácidos grasos presentes midiendo la absorción a 715 nm de la fase isooctano. Los resultados se expresan como nanomoles de ácido oleico liberado por minuto por par de cotiledones.
Para la obtención de los valores de pH deseados se utilizaron los siguientes sistemas buffer: glicina-cloruro de sodio-ácido clorhídrico 0,25 M (pH 1,2-3,4), ácido acético-acetato de sodio 0,25 M (pH 3,6-5,6), fosfato monosódico-fosfato disódico 0,25 M (pH 6,0-7,5), ácido bórico-cloruro de potasio-hidróxido de sodio 0,25 M (pH 8,0-10,0) y glicina-cloruro de sodio-hidróxido de sodio 0,25 M (pH 10,5-12,0).
RESULTADOS
Ensayos de germinación
Cuando las semillas se hacen germinar en la oscuridad a 25°C se requieren 15 días para que el contenido inicial de lípidos disminuya al 30%, en tanto que si la germinación se lleva cabo a 30°C, en solo 7 días el contenido de lípidos disminuye al 20%. Por lo tanto todas las experiencias posteriores fueron realizadas a esta última temperatura.
Variación del contenido de lípidos totales y glúcidos solubles durante la germinación
El contenido de lípidos solo decrece un 9% durante los primeros dos días de la germinación y luego sufre una brusca caída (30% del valor inicial al quinto día), reduciéndose a un 20% al cabo de siete días. El contenido de glúcidos solubles disminuye durante las primeras 24 horas y luego se incrementa concomitante con la caída de los lípidos totales, manteniendo un nivel más o menos constante hasta que el contenido de lípidos residual es un cuarto del valor inicial.
Variación de la actividad lipolítica durante la germinación
Para comprobar si la máxima velocidad de lipólisis in vivo se correlaciona con la aparición de actividad lipolítica in vitro, se incubaron homogenatos de distintos estadios de desarrollo (días 0 a 7), a 37°C, a diferentes valores de pH. En semillas sin germinar no se manifiesta actividad lipolítica, pero la misma ya aparece durante el primer día de la germinación, alcanzando sus valores máximos entre los días dos y tres, decreciendo a partir del día cuatro y haciéndose prácticamente nula el día siete.
La máxima actividad lipolítica en los homogenatos se obtiene a pH 3,7 y 8,5. Un comportamiento similar se obtiene en la capa grasa separada por centrifugación a 11.000 g. El sobrenadante y el pellet carecen de actividad a los pH óptimos, frente a aceite de girasol como sustrato.
DISCUSIÓN
La germinación de semillas de girasol (Helianthus annuus L. cv. ACA 871) en la oscuridad resulta ser un proceso extremadamente sensible a las condiciones térmicas utilizadas: a 25°C se requieren 15 días para que el contenido de lípidos de reserva disminuya a un 30% del valor inicial, en tanto que a 30°C ese valor se alcanza a los 5 días de comenzada la germinación.
Aun cuando la detección de actividad lipolítica in vitro (homogenatos de cotiledones) no necesariamente refleja lo que ocurre en el sistema celular intacto, en este caso se comprueba una aceptable correlación entre la caída de los lípidos (con una fuerte pendiente a partir del segundo día) y la actividad lipolítica in vitro, que es máxima entre los días 2 y 3.
El análisis del contenido de glúcidos solubles es congruente con el comportamiento observado in vivo, ya que el mismo desciende significativamente al cabo del primer día de germinación (período en el que los aceites - principal reserva energética - aún no han comenzado a ser movilizados), pero rápidamente recupera los valores iniciales a favor de la degradación de los lípidos, que proveen los ácidos grasos necesarios para la etapa inicial de la gluconeogénesis.
Todas las experiencias han sido realizadas sobre homogenatos de cotiledones de girasol a los que no se adicionó sustrato, por lo que los valores de actividad lipolítica registrados corresponden entonces a la acción de las enzimas del sistema sobre su sustrato endógeno.
La actividad del sistema lipolítico responsable de la movilización de los lípidos de reserva en plántulas de girasol exhibe dos máximos, a pH 3,7 y 8,5. Los perfiles de actividad en función de los días de germinación para ambos resultan prácticamente superponibles, lo que por ahora no permite sustentar la hipótesis de la existencia de distintas enzimas, a diferencia de los que ocurre en ricino13 y Brassica campestris9.
La actividad lipolítica es nula en el sobrenadante y en el pellet obtenidos por centrifugación a 11.000 g del homogenato, pero se recupera íntegramente en la capa grasa, donde se comprueba que los máximos de actividad coinciden con los valores de pH óptimo encontrados en el homogenato, por lo que la purificación posterior del sistema enzimático deberá partir del tratamiento de la capa grasa con solventes apropiados.
AGRADECIMIENTOS
Al Ing. Agr. José María Bruniard, de la Asociación de Cooperativas Argentinas C.L., por la provisión de semillas de girasol. Al Colegio de Farmacéuticos de la Provincia de Buenos Aires, por su apoyo (estímulo científico) al proyecto "Lipasas de semillas". A la Comisión de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad Nacional de La Plata por la beca otorgada a M. C. Arribére.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Huang, A. H. C. (1984) "Plant upases", en "Lipases" (B.Borgström y H.L. Brockman, eds.), Elservier, Amsterdam, págs. 419-42
- Arribére, M. C. y N. O. Caffini (1988) Acta Farm. Bonaerense 7: 131-41
- Iwai, M. e Y. Tsujisaka (1984) "Fungal Lipase", en "Lipases" (B. Borgström y H.L. Brockman, eds.), Elsevier, Amsterdam, págs. 465-6
- Hassanien, F. R. y K. D. Mukherjee (1986) J. Amer. Oil Chem. Soc. 63: 893-7
- Huang. A. H. C. y Moreau, R. A. (1978) Planta 141: 111-6
- Fusseder A. y R. R. Theimer (1984) Z. Pflanzenphysiol. 114: 403-11
- Chapman, G. W. Jr. (1987) Phytochemistry 26: 3127-31
- Radin, N.S. (1969) Meth. Enzymol. 14: 215-54
- Villalobos, N., F. Simón, L. Martín, M. Herrera y G. Nicolás (1987) Biochem. Syst. Ecol. 15: 551-8
- Dubois, M., K. A. Gilíes, J.K. Hamilton, P. A. Rebers y F.Smith (1956) Anal. Chem. 28: 350-6
- Kwon, D.Y. y J.S. Rhee (1986) J. Amer. Oil Chem. Soc. 63:89-92
- Caffini, N. O., M. C. Arribére y N. S. Friólo (1990), Acta Farm. Bonaerense 9: 183-5
- Muto, S. y H. Beevers (1974) Plant Physiol. 54: 23-8
|
|
|
