TRABAJOS CIENTIFICOS
Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.
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Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
JORNADAS NACIONALES DE ACTUALIZACIÓN SOBRE RECURSOS AROMÁTICOS Y MEDICINALES
Volumen IX - NECOCHEA, 1984 - pág 256 a 268.MEJORAMIENTO GENÉTICO DEL PIRETRO II * - DETERMINACIÓN DE PIRETRINAS PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO * Ingenieros Agrónomos. Docentes de los Departamentos de Biología Aplicada y Producción Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Córdoba.
Orlando MADOERY, Argos A. RODRÍGUEZ, Carlos A. DARRE, Celso CAMUSO y Ricardo MADOERY *
SUMMARY
This paper points out the importance of the correct determination of the total containt and quality of pyrethrins, aiming at the genetic improvement of the pyrethrum plants.
The analytical procedure is based on the identification of peaks and also the quantitative approaches of the components, by means of the micro processing system incorporated to the employed apparatus.
I. INTRODUCCIÓN
El piretro es una de las pocas plantas cultivadas que produce compuestos que se pueden utilizar como insecticidas. Los seis compuestos químicos responsables de tal característica, se denominan genéricamente piretrinas y se puede decir que se localizan en los ovarios y aquenios del disco y las flores radiales liguladas del capítulo que contienen la mayor concentración y por ende la mayor cantidad de principio activo.
La cosecha del capítulo es a mano, luego secado y pulverizado en un tipo de industrialización primaria.
El polvo de piretro y su extracto tienen las siguientes propiedades:
- Repelente de insectos, capacidad de volteo y efectos tóxicos.
- Rápida degradación y nula persistencia residual.
- Capacidad nula por parte de los insectos de generar resistencia.
- Inocuidad para el género humano, aves y animales en general.
- Capacidad de combinación con sinérgidos principalmente butóxido de piperonilo.
Estas condiciones permiten el uso creciente del piretro para controlar insectos domésticos, en cultivos hortícolas que se deben llevar casi de inmediato al mercado, alimentos almacenados e insectos del ganado.
La contaminación ambiental y el riesgo de toxicidad debida a otros insecticidas hacen que el piretro se haya constituido en un cultivo de futuro.
Existen las piretrinas sintéticas que también se integran con los seis componentes de las naturales. Las sintéticas son más toxicas pero tienen algunos inconvenientes que sumariamente son: son menos efectivas en su espectro insecticida, no se combinan adecuadamente con sinérgicos y también son caras.
No obstante, el uso de las piretrinas no es tan intenso como se piensa porque son todavía un tanto más caras que los insecticidas corrientes. La respuesta al problema es producir más piretro por hectárea y para ello es preciso a su vez realizar mejoramiento genético.
II. PRINCIPALES CONSIDERACIONES EN EL MEJORAMIENTO GENÉTICO
Abreviando el problema genético se puede decir que el aumento de productividad se integra con dos componentes, a saber:
- Aumento de la producción de flor fresca por unidad de superficie.
- Selección de plantas con alto contenido de piretrinas.
Para el primer punto Proyecto de Implantación del piretro en la Provincia de Córdoba realiza tareas de selección que toma en cuenta los siguientes factores:
Factores genéticos e intrínsecos
- Genotipo de la planta.
- Número y tamaño de flores.
- Resistencia a enfermedades y nematodes.
Factores no genéticos o agronómicos
- Clima: principalmente precipitación y temperatura en amplitud de respuesta.
- Suelo: composición y estructura. Fertilidad.
- Manejo agronómico: riego; bordeo; deshierbe; labores culturales; distancia entre plantas y entre surcos; implantación del cultivo.
Con respecto al contenido de piretrinas la clasificación es la siguiente:
Factores genéticos
- Genotipo de la planta para cantidad y calidad.
- Época, duración y periodicidad de la floración.
Factores no genéticos
- Secado de flores.
En el proceso de mejoramiento se comprueban algunos hechos de trascendencia, por ejemplo hay una correlación negativa entre gran rendimiento floral y contenido de piretrina por lo cual la obtención de plantas que respondan a ambas características es difícil.
La solución o punto de encuentro es la búsqueda de elevado contenido y razonable rendimiento, pero ¿en qué nivel se sitúa el elevado contenido?
El contenido total de piretrinas según bibliografía consultada varía entre seis por mil al veintidós por mil. En países productores de piretro la línea base selectiva de contenido de piretrina es de catorce por mil para de esta manera garantizar creciente producción de piretrina por hectárea.
La calidad se obtiene por el promedio de Piretrina I sobre Piretrina II que según esta bibliografía consultada varía entre 0,47 y 3,27 con un promedio corriente que oscila entre 0,8 a 1,0.
De hecho la determinación de piretrinas en el material en selección, es completamente indispensable y demostración invalorable de la necesidad de integrar equipos interdisciplinarios para la realización del mejoramiento genético del piretro.
En este caso se ha optado por la línea base entre 10 y 14 por mil para cantidad y elevado porcentaje de Piretrina I con respecto a Piretrina II. Por tanto el proceso analítico es imprescindible.
III. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA DE PIRETRINAS
Se describe la determinación cuantitativa de piretrinas totales y sus componentes en flores de Chrysanthemun cinerariaefolium de varias especies clonales de distintas procedencias empleando el método de la etilendiamina y la cromatografía en fase gaseosa.
El contenido de los principios activos totales se determinó por el procedimiento descripto por Wach y Hanley (1) que consiste en la reacción de la etilendiamina con los ésteres de la ciclopentenolona de los compuestos del piretro, y que reemplaza con exactitud y eficacia a la metodología empleada por la Association of Ofiicial Agricultural Chemist (AOAC) de Estados Unidos de América basado en la reducción de sales de mercurio.
La cromatografía en fase gaseosa ha sido empleada con éxito por muchos analistas para determinar los componentes del extracto de piretro, conocido, vulgarmente como piretrina, en aparatos provistos de diferentes tipos de detectores siendo los de captura de electrones e ionización de llama los más empleados (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).
Se obtuvo una excelente resolución de los distintos componentes con una columna con succinato de neopentilo al 1 % como parte líquida y chromosorb W 60-80 como relleno, aunque otros autores utilizaron Apiezon L sobre chromosorb P silanizado 100-120 mesh (3), SE52 (elastomero de silicona) y SE 30 al 5 % sobre chromosorb W 60-80 mesh (8).
El piretro está contenido en una oleoresina presente principalmente en las flores de las plantas del género Chrysanthemum, lo que se conoce como piretrina es una mezcla formada por derivados del ácido crisantemomonocarboxílico (Piretrina I) y crisantemodicarboxílico (Piretrina II).
Según el tipo de constituyente en el núcleo de la ciclopentenolona, común a ambos, se distinguen tres tipos de compuestos: Cinerina, Jazmolina y Piretrina, conformando así seis estructuras distintas (Tabla 1). Según el grado de purificación se pueden detectar cromatográficamente otros compuestos como los hidrocarburos n-pentacosano, n-heptacosano, n-monacosano sin contar numerosos pigmentos, ceras y resinas que se logran eliminar en distintas fases de la purificación.
l. Aparatos y reactivos - Cromatógrafo en fase gaseosa Varian mod. 3700 equipado con detector a ionización de llama, registrador y sistema integrador y procesador de datos CDS 111.
- Extractor de Soxhlet para extracción continúa de las muestras secas.
- Éter de petróleo fracción 30-60° para extracción de flores.
- Éter etílico, grado técnico destilado.
- Alumina básica, Merck, grado III (3 % de agua) preparada según des cribe Wachs y Hanley (1) y controlada con mezcla de colorante.
- Metilato de sodio 0,05 N en piridina.
- Etilendiamina anhidra, Merck.
- Timolftaleina al 1 % en piridina.
- Piridina anhidra, Merck.
- Cromatoplacas silicagel 60 F254 Merck para cromatografía en capa fina.
- Hexano, Merck.
- Acetato de etilo, Merck.
TABLA I. - DETERMINACIÓN DE PIRETRINAS TOTALES Y SUS COMPONENTES POR EL MÉTODO E.D.A. Y C.G.L. EN EXTRACTOS DE PIRETRO
-
-
-
E.D.A.
E.D.A. Y G.G.L.
C.G.L.
PROCEDENCIA
-Referencia
-Extracto Crudo
%Piretrinas totales
% Piretrina I
% Piretrina II
Comp. Piretrina I
Comp. Piretrina II
% Piretr. I
-% Piretr. II
--
-
-
% cin I
% jaz I
% pir I
% cin II
% jaz II
% pir II
Testigo
-
-
-
-
-
16,01
15,64
68,34
34,63
22,57
42,78
-
-
Japón
03-01
2,0
18,71
11,44
7,26
13,18
19,11
67,69
32,20
27,11
40,67
61,15
38,84
Japón
03-02
2,02
17,3
15,65
1,68
15,03
17,48
67,48
34,28
20,00
45,71
90,30
9,69
Bulgaria
06-13
3,20
22,30
15,36
6,93
33,66
30,99
35,34
31,97
27,74
40,27
68,91
31,08
Bulgaria
06-15
5,35
15,45
12,80
6,63
19,09
11,81
69,09
28,07
24,56
47,36
65,86
34,13
Bulgaria
06-19
4,37
20,80
6,66
14,13
27,58
20,68
51,72
25,20
22,76
52,03
32,04
67,95
Bulgaria
06-25
4,09
22,20
18,77
3,35
38,73
11,71
49,54
48,14
20,98
30,86
84,57
15,12
Bulgaria
06-27
3,80
21,30
17,75
3,54
15,00
30,00
54,58
48,19
39,18
12,61
83,37
16,62
Bulgaria
06-28
3,21
25,2
22,15
3,35
23,02
13,23
63,72
50,00
33,30
16,60
87,17
12,82
Bulgaria
06-34
2,48
25,21
23,62
1,57
5,14
13,11
81,74
30,76
57,69
11,53
93,73
6,26
Bulgaria
06-36
2,61
28,50
12,95
15,54
7,51
12,03
30,45
28,81
41,75
29,43
89,76
10,23
Bulgaria
06-38
2,10
27,16
24,37
2,77
6,82
22,01
71,50
24,50
29,41
46,07
89,76
10,23
Bulgaria
06-40
2,16
28,31
15,61
12,69
12,20
14,58
73,21
31,38
30,01
38,59
55,15
44,84
Bulgaria
06-41
1,70
23,04
9,60
13,43
5,59
12,93
81,46
27,25
27,00
5,75
41,69
58,30
Castelar
08-02
2,12
25,40
23,14
1,89
6,41
21,62
71,95
28,92
24,79
46,18
92,44
7,55
Italia
11-05
2,23
21,41
15,89
5,51
22,19
21,80
56,60
30,82
21,80
47,36
74,22
25,77
Italia
11-06
3,13
27,46
22,98
4,47
11,67
8,38
79,94
23,07
18,46
58,46
83,70
16,29
Italia
11-08
2,10
19,78
18,12
1,64
2,20
11,67
86,12
8,79
15,10
76,09
91,65
8,34
Italia
11-11
2,65
19,32
12,57
6,74
14,23
8,60
77,15
30,24
21,40
48,14
65,08
34,91
Italia
11-17
2,52
19,87
9,81
10,05
16,04
15,43
68,51
26,50
28,91
44,57
49,39
50,60
Italia
11-24
2,10
20,12
15,56
4,55
11,42
14,28
74,28
31,70
14,63
53,65
77,34
22,65
Nueva Guinea
12-04
2,35
25,03
14,54
14,48
5,97
20,02
74,11
17,81
40,07
42,02
50,09
49,90
Nueva Guinea
12-08
2,86
29,47
19,63
11,01
22,34
26,67
50,98
31,84
33,04
35,11
62,62
37,37
Nueva Guinea
12-19
5,12
22,41
18,64
3,75
33,30
30,27
36,42
37,02
34,15
29,63
83,22
16,77
Nueva Guinea
19-25
2,38
21,97
19,75
2,42
22,09
32,75
45,15
42,58
46,71
12,16
89,92
11,04
Nueva Guinea
12-33
2,44
21,77
17,86
3,90
26,40
27,59
45,99
28,05
34,84
37,10
82,06
17,93
Nueva Guinea
12-47
6,78
20,78
18,82
1,95
11,06
16,23
72,07
27,39
32,87
39,72
90,58
9,41
Nueva Guinea
12-56
2,61
22,41
20,18
2,22
20,11
18,76
61,12
50,31
37,68
12,15
90,06
9,93
Nueva Guinea
12-75
2,60
25,80
16,41
9,38
11,01
14,51
74,47
23,85
32,41
43,73
63,62
36,37
2. Métodos experimentales
2.1. Extracción de oleoresina.
Las flores de piretro secadas a temperatura ambiente y luego de triturada convenientemente fueron extraídas en un aparato soxhlet durante 7 horas con éter de petróleo 30-60°. El extracto etéreo obtenido se dejó durante una noche en heladera (0-5 °C) para facilitar la precipitación de ceras y resinas. Finalmente se filtró a través de papel de filtro.
2.2. Purificación del extracto para determinación de piretrinas totales.
Muestras de 100 a 200 mg del extracto fueron eluidas a través de una columna de alúmina grado 3 con una mezcla de éter etílico - éter de petróleo 30 - 60° en proporción 1 : 3 y el eluato fue llevado a sequedad por medio de un evaporador rotatorio. El extracto así obtenido, cuidadosamente pesado, estuvo listo para la valoración por el metodo EDA y el cálculo final se obtuvo por la fórmula siguiente:
% de piretrinas = (A-B) . (normalidad de metilato de sodio) . 350,4 . 100 / Gramos de muestra . 1.000
A = ml de metilato de sodio para la muestra
B = ml de metilato de sodio para el blanco
350,4 = peso molecular promedio de piretrinas
2.3. Purificación del extracto para la determinación cuantitativa por cromatografía gaseosa.
El extracto oleoresinoso obtenido de las flores de piretro por extracción con éter de petróleo 30 -60° durante 7 horas en extractor soxhlet, mantenido en heladera durante una noche, filtrado y evaporado fue purificado por elución en una columna de alúmina neutra con una mezcla de éter etílico-éter de petróleo en la proporción 1:3. Muchos compuestos biológicamente inactivos considerados como piretrinas son retenidos por la columna y el material eluido de la misma son tenidas en cuenta como las verdaderas piretrinas.
Con éxito relativo se utilizó celite y carbón activado para rellenar las columnas cromatográficas.
2.4. Condiciones para la cromatografía en fase gaseosa.
Se utilizó una columna de acero inoxidable de 90 cm por 1/8" de diámetro interno rellena con 1 % de succinato de neopentil glicol como fase líquida en A.W. Choromosorb W 60 - 80 mesh. La temperatura de la columna se programó linealmente desde 150 a 225 grados centígrados a razón de 2 grados centígrados por minuto. El gas portador fue nitrógeno con un flujo de 30 mi/minuto. El inyector se mantuvo a 180 °C y el detector a 240 °C.
2.5. Identificación de picos y cálculos de resultados.
Una solución de 5 mg aproximadamente de una mezcla normalizada de piretrinas (mezcla de esteres de la piretrolona) de pureza 59-60 % (9) por mililitro de éter de petróleo se cromatografió en las condiciones arriba mencionadas. El cromatograma obtenido fue comparado con el que obtuvo Head (4) constatándose una excelente reproducción de resultados (figuras 1 y 2).
Posteriormente se inyectaron soluciones etéreas de concentración similar de los extractos problemas y los picos se identificaron por los tiempos de retención referidos a los de la solución normalizada.
La naturaleza de las piretrinas, tanto de la mezcla normalizada como de los extractos en estudio fue confirmada por cromatografía en capa fina usando cromatoplacas de silica gel 60 F254 en una cámara Desaga refrigerada indicada por Stahl y Ffeifle (10) , eluyéndose con una mezcla de hexano-acetato de etilo-/95 : 5).
La proximación cuantitativa de los componentes de los diferentes extractos en estudio se realizó por integración de los picos en una microprocesadora CDS 111 Varian acoplada al cromatógrafo. Según el autor antes citado, cuando se emplea un detector a ionización de llama los seis componentes principales de la mezcla muestran una buena linealidad a diferentes concentraciones pero las respuestas varían de acuerdo a la naturaleza de éstos, siendo las piretrinas I y II las que desarrollan mayor área relativa, siguiéndoles las cinerinas I y II y finalmente las jazmolinas I y II. De éstas, los derivados del ácido crisantemomonocarboxílico observa mayor sensibilidad que los derivados del ácido crisantemodicarboxílico.
Otro factor que debe tenerse en cuenta en la estimación relativa de cada uno de los componentes es el relacionado con el pico que corresponde a la jazmolina I, pues cuando se trabaja con extractos crudos no purificados, un hidrocarburo, el n-heptacosano interfiere con aquella sumándole un valor aproximado del 25 % que deberá reducirse de la estimación final.
En la tabla I se exponen los resultados totales obtenidos con los extractos oleoresinosos de las diversas especies clónales a los que no se les ha efectuado corrección alguna por no disponerse de material suficiente para aislar cada uno de los componentes e introducir los factores de corrección.
La figura 1 corresponde al cromatograma obtenido por Head (4) y la figura 2 es el de la mezcla normalizada. Las restantes figuras, 3 a 5, son los cromatogramas correspondientes a algunos de los extractos estudiados.
* - Trabajo subsidiado por el Consejo de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Córdoba (CONICOR).
FIGURAS
BIBLIOGRAFÍA
- WACHS, H. y A. HANLEY. Soap ans specialities XLIII (10), October 1967, p. 78. Pyrethrum Post 9 (3). 1968.
- HEAD, S.W. Pyrethrum Post, 8 (4): 3-7. 1966.
- HEAD, S.W. Pyrethrum Post, 7 (4): 12-14. 1964.
- --------- Pyrethrum Post, 9 (1): 12-17. 1967.
- --------- Pyrethrum Post, 9 (2): 1967.
- TETENYI, P., E. HETHELYI, T. OKUDA et al. Pyrethrum Post, 11 (1): 1971.
- BEVENUE, A., Y. KAWANO y F. DELANO. J. Chromatogr. 50: 49-58.1970.
- SHEKMA, J. Analytical methods pesticides and plant growth regulators, 8:225-236. 1976.
- UNITED STATE ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENS. Health Effects Research Laboratory, Environmental Toxicology División, Research Triangle Park, NC 27711. (Suministra la mezcla normalizada).
- STAHL, E. y J. PFEIFLE. Pyrethrum Post, 8 (4). 1966.
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