* Miembro de la Carrera del Investigador Científico y Tecnológico del CONICET.
** Ingenieros del Laboratorio de Investigaciones Dr. Gustavo A. Fester, de las Cátedras de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, Universidad Nacional del Nordeste - Corrientes, Argentina.

ANTECEDENTES

El aceite esencial de bergamota Citrus bergamia Risso o Citrus aurantium L. subsp. bergamia (Risso et Poit.), constituye una materia prima apreciada en perfumería y cosmética por su aroma característico muy agradable y fino, que armoniza con otros aceites a los que exalta introduciendo una nota fresca en perfumes, colonias, aromas para tabaco, etcétera.

Ya mucho tiempo atrás se atribuyeron propiedades farmacológicas o fisiológicas a algunas plantas (bergamota, perejil, apio, hinojo, etc.), con contenidos apreciables de furanocumarinas o psoralenos y cuyos aceites esenciales, extractos o derivados han hallado empleo en el tratamiento de la psoriasis y el vitiligo o leucoderma, (Rovesti, 1978; Baccichetti, Borodin, Dall'Acqua, Guiotto, Pastorini, Rodighiero G., Rodighiero, P. y Vedaldi, 1981).

Diversos investigadores han examinado la actividad fotosensibilizadora y la toxicidad de las furanocumarinas (Musajo, L. y Rodighiero, G., 1962; Caporale, G., Musajo, L., Rodighiero, G. y Baccichetti, F., 1964; Caporale, G. y Bareggi, A.M., 1968); como también el mecanismo de su acción sobre la piel, atribuyéndose a las sustituidas en 4, en 5 y principalmente en 8, y a los aceites esenciales que las poseen la posibilidad de provocar afecciones cutáneas, eritemas por acción de la radiación solar, ó fotodermatosis y daño a las células epidérmicas cuando se las aplica sobre la piel. (Ali, R. y Agarwala" S.C., 1969; Dall'Acqua, F., Marciani, S. y Rodighiero, G., 1969; Bordin, F., Musajo, L. y Bevilacqua,R., 1969; Pathak, M.A. y Fellman, J.H., 1960; Pathak, M.A., Worden, L. R. y Kaufman, K.D., 1967; Pathak,' M.A. y Kramer, D.M., 1969; Wis-kemann, A., 1972; Campanella, 1973; Rovesti, P., 1978; Gatti, G.L. y Salvatore, 1978).

La acción fotosensibilizadora de los 8- y 5- metoxipsoralenos, que es independiente de la acción o presencia del oxígeno del aire ha llevado a su empleo en lociones y cremas bronceaduras para la piel, junto a sustancias protectoras que actúan filtrando la radiación ultravioleta de corta longitud de onda. También se los ha empleado por vía oral para el tratamiento dermatológico de las psoriasis. (Pathak, M.A. y Fellman, J.H., 1960; Krauch, C.H., Farid, S., Kraft, S. y Walcker, A., 1965; Gatti, G.L. y Salvatore, G., 1978 ; Taddei, I., 1972).

Se atribuye sin embargo a tales sustancias la aptitud para insertarse por acción de la radiación ultravioleta y mediante una doble unión química en la molécula del DNA, evitando así su replicación y pudiendo actuar induciendo mutaciones celulares y como cancerígenas. (Stern, R.S. y col., 1979; Lañe Brown, M.M. y col., 1981; Zajdela , F. y Bisagni, E., 1981).

Ello ha llevado a aplicar restricciones al uso del aceite natural de bergamota por su contenido en 5-metoxipsoraleno o bergapteno, restricciones que por otra parte han sido controvertidas en sus fundamentos y en sus consecuencias. (Di Giacomo, A., 1973).

En el aceite de bergamota se ha reconocido la presencia de las siguientes cumarinas y furanocumarinas: el bergapteno o 5-metoxipsoraleno; la bergamotina o 5-geranoxipsoraleno; el citropteno o 5,7-d'imetoxicumarina y la 7-metoxi-5-geranoxicumarina. (Calvarano M. , 1961).

La valoración del contenido de bergapteno en tal aceite ha sido objeto de varias investigaciones, llegándose a valores bastantes dispares de acuerdo a los procedimientos analíticos usados como también a la muestra examinada.

Recientemente, Di Giacomo, A. y Calvarano, M. (1978), en un trabajo crítico examinando 125 muestras de aceite puro obtenidas industrialmente en Calabria por expresión mediante máquinas raspadoras Speciale, aplicando la cromatografía líquida de alta presión establecieron los límites de contenido de bergapteno entre 0,204 a 0,475 % y por cromatografía en capa delgada y espectrofluorometría, entre 0,178 a 0,386 % pero comprobando asimismo, mediante la valoración de patrones, que este último procedimiento provee valores menores hasta en un 28,52 %.

La caracterización e identificación de cumarinas y furanocumarinas mediante el examen de los espectros de ultravioleta (índice CD), de infrarrojo, de resonancia nuclear magnética protónica y de carbono 13 ha sido expuesta en numerosos trabajos. (La Face, D., 1959; Calvarano, M. y Calvarano, I., 1964;- Briggs, L.H. y Colebrook, L.D. 1960; Stanley, W.L. y Vannier, S.H., 1967; Méndez, J. y Lojo, M.I., 1968; Kuo-Hsiung Lee y Soine, T.O., 1969; Steck, W. y Bailey, B.K., 1969; Karlsen, J., Boomsma, A., 1969; Guiotto, A., Rodighiero, P. y Fornasiero, U., 1973).

La eliminación del bergapteno del aceite natural no es fácil, sin modificar las restantes características físicas, químicas y olfativas del mismo. Puede hacerse por destilación fraccionada al vacío, en cuyo caso simultáneamente puede deterpenarse el aceite y eliminar asimismo el residuo no volátil; con lo primero se mejora la solubilidad del aceite, con lo segundo se elimina el bergapteno pero también diversos componentes que contribuyen a la conservación del aceite.

Un segundo procedimiento consiste en la extracción de las cumarinas por tratamiento con soluciones de hidróxido de potasio, (el hidróxido de sodio si bien solubiliza diversas cumarinas no lo hace con el bergapteno), pero en este caso no se logra una extracción total de la furanocumarina pudiéndose producir transformaciones en componentes menores por efecto del álcali.

En la clásica obra de Güenther, E. (1949), se expresan las características de aceites de bergamota deterpenados según establecidas por Romeo (1926), y por Fritzsche, Br., indicándose los límites siguientes:

Los autores en un trabajo anterior evaluaron la calidad y composición del aceite esencial de bergamota obtenido comercialmente por expresión con máquinas FMC (a diferencia del aceite italiano) y a partir de frutos en estado de madurez adecuada, provenientes de un cultivo de Misiones. (Ricciardi, A.I.A., Agrelo de Nassif, A.E.,. 0livetti de Bravi, M.G., Peruchena de Godoy, N.M. y Molí, T.M.,1982).

En el presente trabajó el interés de los autores se ha centrado en:

1. Evaluar la calidad del aceite deterpenado y descumarinizado obtenido por destilación fraccionada al vacío del aceite genuino, en condiciones controladas de escala piloto, y estimando la presencia del bergapteno mediante el examen del espectro UV a 310-320 nm y determinando el índice CD; por cromatografía en capa delgada y por espectrometría de resonancia nuclear magnética protónica, procedimiento éste último en el cual los picos muy característicos del bergapteno pueden ser reconocidos indudablemente sin interferencias y aun en el aceite original. Este control se ha realizado tanto en las fracciones destiladas de componente oxigenados (aceite deterpenado y descumarinizado) como también al residuo seco obtenido de las mismas por evaporación según las condiciones normales.

2. Evaluar la calidad del aceite deterpenado y descumarinizado obtenido por igual procedimiento a partir del aceite de bergamota recuperado por filtración al vacío de los residuos de fábrica.

En un posterior trabajo se expondrá la evaluación y recuperación de cumarinas y furanocumarinas a partir del residuo insoluble, actualmente un "caput mortum" de fábrica.

PARTE EXPERIMENTAL

Todos los dosajes han sido realizados por los procedimientos normales; los alcoholes terciarios han sido valorados por acetilación según Fiore, con calentamiento durante 16 horas a 40° C; los valores de acidez están expresados como ácido acético %; los de ésteres como acetato de linalilo %; los alcoholes como linalol %; los de carbonílicos como citral %.

Los espectros de ultravioleta han sido medidos en espectrómetro Beckman DBG, con celda de cuarzo de 10 mm de paso óptico y, salvo que se advierta lo contrario, en concentración de 50 mg por 100 ml de etanol, contra éste último como blanco. Se han calculado los valores CD por el procedimiento usual.

Los espectros de infrarrojo han sido realizados en un espectrómetro Infracord 137 de Perkin Elmer, en microcelda sellada de cloruro de sodio de 0,025 mm de espesor.

Los espectros de resonancia magnética nuclear protónica han sido realizados en un espectrómetro Varian EM-360 A, de 60 MHz; los del aceite esencial se han determinado directamente con el agregado de un 20 % de tetracloruro de carbono y un 2 % de tetrametilsilano; los espectros de residuos de evaporación determinados tomando el residuo de la evaporación de 5 ml de aceite con deuterocloroformo y agregado de tetrametilsilano.

Los controles cromatográficos han sido realizados con un cromatógrafo Carlo Erba Fractovap 2400 T, con columna capilar de acero inoxidable de 0,5 mm de diámetro interno por 50 m y rellena con Carbowax 20 M , a 165° C y con detección por ionización de llama; gas portador N₂.

La destilación fraccionada al vacío se ha llevado a cabo en una columna Normschliff/Friedrich-Matschke, de 100 cm de longitud de relleno y 30 mm de diámetro, con relleno de anillos de Fenske de acero inoxidable de 3 mm de diámetro, 17 platos teóricos y 15 ml de holdup, aislación por camisa al vacío, con condensador de reflujo parcial, refrigerante descendente y separador de fracciones de Pauli modificado. El corte de la fracción de terpenos se ha realizado al terminar de pasar el p-cimeno, según las curvas de destilación, luego bajando la presión se ha recogido como fracción de oxigenados todo lo destilado. La ebullición se ha regulado por inyección de anhídrido carbónico.

Materia prima

Se han utilizado dos aceites esenciales, el primero (I) obtenido en escala industrial de los frutos de bergamota con equipo FMC; el segundo (II), recuperado por filtración por succión a partir del residuo precipitado durante el estacionamiento del aceite (I) en fábrica, residuo que se separa por decantación; se logra un 34% de aceite quedando en el filtro una masa harinosa.

En el cuadro II se exponen las características de ambos aceites.

De acuerdo al espectro ultravioleta se observa en el máximo a 314 nm correspondiente al bergapteno una proporción mucho mayor en el aceite recuperado del residuo con índice CD doble al aceite original. Esta misma diferencia se observa en el espectro de R.M.N. examinando el doblete centrado a 7,75 ppm (J = 10 Hz) correspondiente al H₄ del anillo cumarínico y el doblete centrado a 7,30 ppm (J = 3 Hz) y típico del H₂ en el anillo furánico.

En la cromatografía en capa delgada se observan siete manchas fluorescentes con las siguientes características:

Se ha utilizado como patrón una muestra auténtica de bergapteno separada del aceite y controlada por el espectro de u.v. de i.r. y de n.m.r.; p.f. 180-185° C.

L y H - colorantes normalizados
1 - Bergapteno
2 - Aceite mayo 81
3 - Aceite fracción oxigenados
4 - Residuo seco fracción oxigenados (aceite mayo 81)
5 - Aceite extraido con NaOH
6 - Aceite extraido con KOH
7.- Residuo seco fracción oxigenados (residuos)
8 - Aceite de residuos fracción oxigenados
9 - Aceite de residuos

Destilación del aceite I:

800 mi de aceite se destilan con relación de reflujo 4:1, separando dos fracciones y un residuo en las condiciones y con las características expresadas en el cuadro IV.

En la cromatografía en capa delgada tanto de la fracción de oxigenados, como del residuo seco de ésta no se observan manchas fluorescentes. En el espectro ultravioleta sólo aparece una ligerísima absorción a 312 nm (índice CD 0,0031); y en el espectro de r.m.n. no se aprecian los picos del bergapteno. Por lo tanto se considera que en la fracción de oxigenados (aceite deterpenado) no se observa la presencia de furanocumarinas, o su contenido está en el límite de detección.

En el cuadro VI se expresa la concentración de los principales constituyentes de acuerdo a la cromatografía en fase gaseosa.

Destilación del aceite II:

1.475 ml de aceite recuperado del residuo (borras) de fábrica se destilan en condiciones similares a las descriptas para el aceite I, y en el cuadro V se expresan las características de las fracciones separadas

Tampoco en este caso se observa en la cromatografía en placa delgada la presencia de manchas fluorescentes, ni en el aceite deterpenado, ni en el residuo, seco del mismo; como tampoco en el espectro de r.m.n.; en el espectro ultravioleta se observa una ligerísima absorción (índice C D 0,0075) a 312 nm.

En el cuadro VI se expresan las concentraciones de los principales constituyentes de acuerdo a la cromatografía en fase gaseosa.

Solubilidad de los aceites deterpenados:

La eliminación de los hidrocarburos livianos y de los componentes no volátiles se manifiesta en un gran aumento de la solubilidad; que en etanol de 70% pasa a ser totalmente soluble en 2,28 ml para el aceite deterpenado I y totalmente soluble en 2,60 ml para el aceite deterpenado II.

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Por destilación fraccionada al vacío se obtiene un aceite de bergamota deterpenado, descumarinizado y sin residuo seco; aumentando notablemente en tal forma su solubilidad en alcohol diluido. La ausencia de furanocumarinas permite su utilización en perfumes y cosméticos sin ulteriores restricciones.

Indudablemente, si bien el aceite conserva un aroma sumamente agradable hay una ligera variación respecto al aceite original, lo que debe ser tenido en cuenta al reelaborar las formulaciones perfumísticas. Si bien se han eliminado algunas sustancias del residuo seco que pueden actuar como antioxidantes, facilitando la preservación del aceite, también se ha eliminado la mayor parte del γ-terpineno que por su oxidación al p-cimeno, según el proceso conocido contribuye a la expoliación del aceite.

Otros procesos que permiten la eliminación de las camarinas han sido empleados en Italia, sin que se haya dado detalles de los mismos, y probablemente consistiendo en tratamiento con soluciones de hidróxido de potasio en caliente; Di Giacomo y Calvarano (1978 ), han examinado la presencia de bergapteno en tales aceites, y en 7 muestras han observado contenidos que van desde 0,042 a 0,0004%.

La aplicación del procedimiento a la recuperación de los aceites de residuos o borras de fabrica, permite lograr,a partir de un "caput mortum" industrial un aceite deterpenado de excelente calidad y comparable al obtenido de la esencia genuina, permitiendo a la vez el aprovechamiento del residuo insoluble.

CONCLUSIONES

La deterpenación y descumarinización del aceite de bergamota obtenido industrialmente en Misiones, por destilación fraccionada al vacío permite obtener un aceite de alta solubilidad, excelentes características olfativas, sin residuo insoluble ni colorantes, que conserva en su casi totalidad el aroma fresco del aceite original; la eliminación de las furanocumarinas del aceite original posibilita su empleo en perfumería y cosmética sin restricción u objeción alguna.

El procedimiento puede aplicarse a la recuperación, dé los aceites de residuos de fábrica, disponiendo del material sólido residual para el aprovechamiento de las furanocumarinas.

Agradecimientos:

Al Ing. Quím. Ernesto T. M. Molí y a la Cooperativa Agrícola Eldorado, Soc. Coop. Ltda. de Misiones, la gentil provisión del aceite y residuos utilizados.

A los Dres. Ignazio Calvarano y Angelo Di Giacomo de la Stazione Sperimentale per l'Industria delle Essenze e dei Derivati Agrumari de Reggio Calabria (Italia) por el envío de sus valiosos trabajos sobre el tema.

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