Las esencias de hespérides o rutáceas cítricas son de empleo muy difundido; tanto en la industria de perfumería (las de bergamota, limón, naranja dulce y amarga bigaradia, petitgrain y neroli) como en bebidas y alimentos (esencias de limón, naranja, mandarina, pomelo, lima, cidra). Estas esencias son obtenidas generalmente de las cáscaras de los frutos (salvo la de neroli que se obtiene de las flores o azahares) por expresión a mano o mediante máquinas especiales (sfumatrices y pellatrices) o por destilación por arrastre. En estas esencias la fracción de hidrocarburos terpénicos (en la que predomina el limoneno) es muy grande frente a la de los componentes oxigenados y presenta el inconveniente de su fácil oxidabilidad, con la consiguiente modificación adversa del aroma del producto. Para salvar ese inconveniente se practica el deterpenado, o eliminación de hidrocarburos terpénicos mediante distintos procedimiemos (separación de los componentes oxigenados con alcohol de baja graduación en el que los hidrocarburos son insolubles, destilación analítica a presión reducida, o fraccionamiento en columna cromatográfica). Resulta una fracción menor de componentes oxigenados, intensamente aromática y más estable, muy cotizada.

La cromatografía gaseosa, aplicada al estudio de las esencias cítricas ha permitido confirmar las composiciones encontradas aplicando otras técnicas analíticas y revelar la existencia de otros componentes menores, empleando cantidades muy pequeñas de muestra, del orden de los 5 a 10 microlitros.

Cabe citar al respecto los trabajos de R. A. Bernhard (Universidad de California, 1961) que en esencia de naranja var. Valencia, de cultivos de California, encontró 50 componentes. Practicó un fraccionamiento previo por cromatografía en columna, cromatografiando luego en fase gas-líquido, por separado, la fracción terpénica hidrocarbonada y la fracción de componentes oxigenados. Informa haber encontrado en esta forma 14 componentes que hasta esa fecha no habían sido identificados en la esencia de naranja dulce.

Por su parte, otro investigador, R. M. Way (USA, 1963) por cromatografía gaseosa, con programación de temperatura y usando helio como gas vector encontró 37 componentes en esencia de limón de Mesina. Se transcribe un cromatograma obtenido por este investigador, con indicación de las condiciones de trabajo.

En la cromatografía de las esencias de cítricos se choca con el inconveniente del alto contenido en hidrocarburos terpénicos que dificulta la identificación de los componentes oxigenados. Puede salvarse este inconveniente separando la fracción más volátil rica en hidrocarburos terpénicos por destilación analítica al vacío, conducida hasta separar la mayor parte del limoneno con lo que la esencia quedará concentrada en sus componentes oxigenados (se las llama esencias concentradas, habitualmente 1/4 o 1/6 del volumen total); o bien separa la fracción de hidrocarburos terpénicos por pasaje a través de una columna cromatográfica de ácido silícico que no los retiene, en tanto adsorbe los componentes oxigenados que luego se pueden eluir de la columna mediante éter etílico.

Los cromatógrafos de gases corrientes, a termistores, sin programación de temperatura y usando nitrógeno como gas vector, no permiten obtener una resolución tan completa, aunque sí separar los componentes más importantes y controlar con relativa rapidez y sobre muy pequeña cantidad de muestra, según lo dicho antes, la calidad de las esencias, comparándolas entre sí y descubrir muchos adulterantes. La resolución será mejor trabajando sobre el aceite fraccionado según se acaba de explicar y también cromatografiando por separado, por ejemplo la esencia libre de componentes carbonílicos absorbidos con solución saturada de sulfito de sodio y éstos últimos luego de liberados de la combinación con el sulfito por tratamiento alcalino. También puede hacerse un fraccionamiento previo de la esencia mediante una columna separativa o fraccionadora que permite operar con cantidades de muestra del orden de los cinco mililitros.

En el caso de la esencia de bergamotas cuyo contenido en hidrocarburos terpénicos es mucho menor que en las de limón, naranja, pomelo y mandarina, la cromatografía puede obtenerse sobre la esencia completa.

Se transcriben los cromatogramas obtenidos:

1. de esencia de bergamota (Citrus bergamia Risso) original de Reggio de Calabria - Italia, sobre 5 microlitros de esencia completa, usando un cromatógrafo Perkin Elmer, modelo 154-C a termistores, con columna de polisuccinato de dietilenoglicol sobre chromosorb, de un metro de largo y 1/4 de pulgada de diámetro; a 150° C y presión de nitrógeno de 4 psi (flujo de 21,8 ml / minuto);

2. de esencia de naranja dulce (Citrus sinensis) siciliana, sobre 3 microlitros de esencia deterpenada por destilación a presión reducida, usando las mismas condiciones que para la esencia anterior;

3. de esencia de limón (Citrus medica L. o Citrus limonum Risso) de Tucumán - Argentina sobre 5 microlitros de esencia deterpenada por destilación analítica y en iguales condiciones que las anteriores;

4. de la misma esencia de limón anterior una vez eliminados los componentes carbolíticos absorbibles con solución saturada de sulfito de sodio. En este caso se usó una columna de "saib" (diacetato -hexaisobutirato de sacarosa) al 10% sobre tierra de infusorios, de dos metros de longitud y ¼" de diiámetro, a 150° C y presión de 7 psi de nitrógeno (flujo 21 ml / minuto);

5. de la fracción absorbida con solución saturada de sulfito sódico de la misma esencia de limón y en las condiciones del cromatograma anterior. Obsérvese como la separación de los carbonílicos permite ubicar en el cromatograma 4° al nerol y geraniol y sus acetatos, que en el Cromatograma de la esencia (3°) se mezclan con los picos del neral y del citral; en el cromatograma 5° estos aparecen libres de la interferencia señalada.

6. de esencia de mandarina (Citrus nobilis var deliciosa Swingle o Citrus reticulata Blanco) de Entre Ríos - Argentina, concentrada por destilación analítica al vacio a 1/6, Se usó columna de "saib" de dos metros de largo por 1/4" de diámetro, a 200° C y presión de nitrógeno de 6 psi (flujo de 13,3 ml/minuto);

7. de la fracción de la esencia de mandarina anterior no retenida por columna de Ácido silícico de 90 mallas (20 x 2 cm); se empleó la misma columna que para el cromatograma 6° y en condiciones similares. Se comprobó que en esta fracción junto con hidrocarburos terpénicos ha pasado el rnetil entranilato de, metilo (último pico);

8. de la fracción de la esencia de mandarina anterior, retenida por adsorción en la columna de ácido silícico mencionada para el 7°, eluida con éter etílico; la columna y las condiciones de trabajo iguales que para el 7°. En el cromatograma 1° los picos principales corresponden a los siguientes componentes; el 3 a acetato de linalilo, el 4 a limoneno, el 9 a linalol, el 13 a acetato de nerilo y el 14 a acetato de geranilo (más nerol).

En el cromatograma 2° los picos principales corresponden: el 2 a actanal, el 3 a nonanal, el 5 a decanal, el 6 a linalol, el 9 a dodecanal, el 10 a dodecanol, el 11 a neral y el 12 a geranial.

Se recomienda en consecuencia trabajar con programación de temperatura, con helio y detectores sensibles, así como el fraccionamiento, especialmente mediante columna cromatográfica de ácido silícico.

V. Componentes fenólicos y sus éteres.

Son los fenoles y sus éteres componentes muy difundidos de las esencias llegando a predominar en algunas e influyendo siempre en su aroma por su olor peculiar; tanto más cuanto es su proporción y según cual sea su estructura química.

Como casos típicos de esencias que los contienen y cuyo aroma está íntimamente vinculado a su presencia, se pueden citar:

1. El aceite esencial de clavo de olor o Eugenia caryophylata, que contiene 82 a 92 por ciento de eugenol;

2. el aceite esencial de "bay" o Pimenta acris K, con 50 a 70 por ciento de eugenol;

3. el aceite esencial de Pimenta officinalis o de Jamaica, con 65 a 80 % de eugenol;

4. el aceite esencial de hojas de canela (Cinnamomum Zeylanicum) con 70 a 90 por ciento de eugenol;

5. el aceite esencial de betel o Piper bettle, con 39 a 70 por ciento de eugenol;

6. la esencia de clavel o Dianthus caryophillus, con 30 por ciento de eugenol;

7. el aceite esencial de tomillo o Thymus vulgaris con 30 a 50 por ciento de timol y carvacrol;

8. el aceite esencial de orégano u Origanum vulgare L. con hasta 64,4 por ciento de timol y carvacrol;

9. el aceite esencial de Satureia montana L, o pimienta de asno, con 65 por ciento de carvacrol;

10. el aceite esencial de Barosma betulina Thumb. o "buchú", con 20 a 30 por ciento de diosfenol;

11. el aceite esencial de "huan huan" o Laurelia serrata Philip., con aproximadamente 20 por ciento de éteres de fenoles (safrol, metileugenol y dillapiol y 9 por ciento de eugenol);

12. el aceite esencial de perejil o Petroselinum hortense, con aproximadamente 3 por ciento de apiol y miristicina;

13. el aceite esencial de nuez moscada y de macis, o Mirística fragrans, con 4 por ciento de miristicina, safrol, eugenol e isoeugenol;

14. el aceite esencial de Orthodon formosanum con 65 por ciento de dillapiol;

15. el aceite esencial de sasafrás o Sassafras officinalis N. et Eb. y Ocotea pretiosa, con hasta 80 por ciento de safrol;

16. el aceite esencial de anís estrellado o Illicium verum con alto porcentaje de anetol (superior al 90 %).

17. el aceite esencial de Illicium parviflorum Michx. con hasta 90 % de safrol;

18. el aceite esencial de Pimpinella anisum, anís, con 80 a 90 % de anetol;

19. el aceite esencial de Foeniculuía vulgare, o hinojo, con 70 a 90 por ciento de anetol y metil-chavicol o estragol.

Los componentes fenólicos más importantes en las esencias son: el eugenol, considerado el de olor más agradable; el isoeugenol; el timol; el carvacrol; el diosfenol (di-fenol) y en menor proporción el australol, el chavicol, el chavibetol, cresoles, xilenoles, etc. Entre los éteres de fenoles; el safrol, el metileugenol, el apiol, el anetol, el metilchavicol o estragol, la miristicina, el dillapiol, etc.

Existen otros componentes fenólicos con función mixta, algunos muy importantes en las esencias; tales la vainillina (aldehido fenol) el aldehido salicílico (aldehido fenol), el piperonal o heliantina (aldehido-éter de fenol), el peonol, la eugenona, la aniscetona, la betametoxiacftofenona, la orto-hidroxi-acetofenona, etc. y el acetileugenol (éster acético del eugenol).

Los componentes fenólicos son separados, generalmente, de los aceites esenciales por absorción con solución al 0,5% de HOK y estudiados luego de liberarlos con ácido mineral, sea por preparación de sus 3-5-dinitrobenzoatos, picratos, di-feniluretanos o p-toluen-sulfanatos, etc, que presentan puntos de fusión típicos.

Las técnicas modernas de análisis incluyen la espectrofometría en ultravioleta y en infrarrojo, la cromatografía en columnas de ácido silícico (poco eficientes) o en placas recubiertas con ácido silícico empastado con almidón o con yeso, y la cromatografía gaseosa.

La estimación de los éteres de fenoles se realiza generalmente por determinación de los metoxilos o por precipitación como sal compleja con acetato mercúrico y cloruro de sodio, picratos, derivados bromados, etc. Se aplica también la espectrofotometría. Montes ha encontrado que, una vez separados los componentes fenólicos con función fenol libre por absorción con álcali, se pueden separar los éteres de fenoles por cromatografía sobre placa recubierta con ácido silícico, usando como disolvente para desarrollo una mezcla de éter de petróleo-acetato de etilo en las proporciones 8:2, revelando con el mismo reactivo que se emplea para los fenoles, la p-nitroanilina diazotada diluida en buffer acetato sódico pH 7,0, con la que reaccionan más lentamente (para fenol con Rf 1,0 dan: el metileugenol 1,20; el estragol 1, 56; el anetol 1, 56; el safrol 1, 50 y la heliotropina 0,75.

La cromatografía gaseosa es considerada actualmente como un meétodo muy útil en la identificación de mezclas de componentes fenólicos que resuelve la mayor parte de los problemas, empleando muy pequeñas cantidades de muestra, del orden de los 10 microlitros.

El autor ha estudiado la separación mediante esta técnica de los éteres de fenoles y otros derivados y con la Dra. Aída T. Vázquez las de los fenoles propiamente dichos, empleando distintas fases fijas y diversas condiciones experimentales.

Se han obtenido los resultados que pueden observarse en los cromatogramas y tablas que se adjuntan para las mezclas que en cada uno se detallan y empleando come fases fijas: la "P" p polisuccinato de dietileno glicol; la "saib" o diacetatohexaisobutirato de sacarosa; la "R" o polipropilenoglicol o Ucon-X de peso molecular 550, la "O" o grasa de silicona y la "Q" o apiezon L; en las condiciones experimentales que se detallan en cada caso, usando como gas vector nitrógeno puro y seco. Los tiempos de retención correspondientes a los distintos fenoes cromatografiados, con cada una de las fases fijas mencionadas, se han anotado en relación al del fenol tomado como unidad.

Cuando se emplean fases fijas no polares, como la "O" y la "Q" se comprueba que los fenoles son eluidos en el orden de su temperatura de ebullición como si se tratara de una destilación analítica; no asi cuando se usan fases fijas "polares" como la "P" , la "R" y la "SAIB", con las que se obtiene un orden diferente para cada una.

La combinación de dos columnas, con distintas fases fijas, mejora la separación de los fenoles en algunos casos, como puede observarse.

En general según lo demuestran los cromatogramas, es buena la se -paración de los distintos fenoles que peden encontrarse en los aceites esenciales, salvo el caso particular de la mezcla de m -cresol y p-cresol, y se logra si no con una columna, a través de dos cromatografías realizadas con distintas fases fijas.

Para los éteres de fenoles más corrientemente hallados en aceites esenciales. Montes ha encontrado los siguientes resultados:

Dado que frecuentemente se encuentran presentes en las esencias fenoles y éteres de fenoles, conviene, para su mejor identificación, separar mediante álcali diluido los fenoles para estudiarlos por separado y proceder a la identificación de los éteres en la esencia residual.

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