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Boletín SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
Volumen I - Boletín N 3 - Set-Dic 1962 - pág 1 a 17.


LA CROMATOGRAFÍA GASEOSA EN EL ESTUDIO Y CONTRALOR DE LOS PRODUCTOS AROMÁTICOS
Por Adollfo Leandro Montes *

* Dr. en Química. Profesor de Bromatología Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad Nacional de Buenos Aires.

N. de la D.: Iniciamos, con el presente, una serie de artículos sobre la aplicación de la Cromatografía gaseosa, en el estudio y contralor, de los productos aromáticos. En este primer articulo se hace una introducción, breve, sobre la técnica en sí, los detalles y alcances de su aplicación; pasando luego al primer caso a considerar, el de los aceites esenciales de distintas especies de menta.

Introducción

La evolución de la cromatografía, muy acelerada en los últimos veinte años, ha conducido a una técnica nueva, partícularmente notable por su poder resolutivo de mezclas y sensibilídad, que se está difundiendo rápidamente por el mundo civilizado; en tanto se multiplican sus aplicaciones, al perfeccionarse los aparatos mediante los cuales se aplica, y conforme se encuentran formas más volátiles y estables al calor para muchos productos químicos que no podían ser cromatografiados en sus condiciones originales.

Esta nueva técnica, de muy reciente desarrollo, creada en base a los estudios de Martin y Singe (1941) y de Martin y James (1950), ha sido denominada cromatografra en fase gas líquido, o gas-sólido, o simplemente cromatografra en fase gaseosa, o cromatografra gaseosa ("gas chromatography"); debido a que es un gas el vector o "córner" que reemplaza a la fase líquida de desarrollo de las otras técnicas cromatográficas, acelerando el desarrollo del proceso de separación y tomándolo más efectivo.

Se usan fases liquidas, sobre soporte inerte, en la técnica gas-líquido, la más aplicada; o fase sólida en la gas-sólido, de aplicación mucho más limitada (por ejemplo en la separación de hidrocarburos volátiles, hasta C3).

Las fases líquidas, con las que el gas efectúa la partición cromatográfica, son muy variadas, polares o no polares, capaces de soportar sin descomposición distintas temperaturas y, de acuerdo a sus propiedades, se usan en la separación de los distintos productos. Son, generalmente, polímeros resistentes al calor, polares o no polares. Entre los polares los más usados: el polisuccinato o poliadipato de polietileno glicol, polipropileno glicol, óxido de poliestirilo, saib o diacetato-hexaisobutirato de sacarosa, beta, betabis-propioni-tril-éter fosfato de tricresilo, difenilformamida, etc; entre los no polares: el apiezon L, el apiezon M (hidrocarburos de alto peso molecular), los aceites y grasas de silicona, el escualeno y los aceites y ceras de parafina.

Los soportes sólidos para la fase fija deben ser de grosor mediano (malla 60 a 100) e inertes frente a la fase y frente a los productos a cromatografiar; se usan tierras de diatomeas, polvo de vidrio, polvo de ladrillo, etc. debidamente lavados y tamizados.

Los gases vectores más usados son el nitrógeno, puro y seco; el helio puro; pudiendo usarse otros si conviniese para un de terminado tipo de producto a cromatografiar; conviene estén libres de oxigeno sobre todo cuando se trata de productos fácilmente oxidables.

Se ha comparado la cromatografía gaseosa a una destilación analítica, de muy alto poder resolutivo, calculándose el número de "platos teóricos" por metro en más de mil. El número de platos teóricos para una determinada columna se calcula teniendo en cuenta, para un pico determinado el tiempo de retención y la base (w):

N de platos teóricos (P.T.) = 16.(tr)2 / W

Se llama tr (tiempo de retención) al tiempo, en minutos, que transcurre desde el comienzo del cromatograma hasta que se registra la cumbre de cada pico, correspondiente a una determinada sustancia. Se llama vr (volumen de retención) al producto del tr por el flujo del gas vector (ml/min) para cada sustancia.

Ambos pueden expresarse, si así conviene a los fines de identificación, con respecto a un componente común elegido como unidad. Se suelen usar también otras magnitudes más específicas.

Las columnas de separación se hacen de material inerte, como acero inoxidable, aluminio o vidrio, de 1/4 o de 1/8 de pulgada de diámetro y de la 18 m de longitud, en forma de U o de espiral; las tipo Golay son capilares y de longitud mayor (50 o más metros).

La salida de cada componente de la columna es detectada mediante distintos sistemas, a saber:

  1. Mediante katarómetros. Se registran en este sistema, los cambios de conductividad térmica del efluyente. Se usan hilos metálicos o termistores calientes, de platino o de tungsteno, cuya temperatura es función de la conductividad térmica del gas que los rodea. A su vez, la temperatura del hilo determina su resistencia eléctrica.
  2. De ionización a la llama. Se registra la conductividad eléctrica de la llama por combustión de hidrógeno con las sustancias que efluyen, en presencia de oxígeno. Es mucho más sensible que el anterior.
  3. El sistema que usa argón activado mediante radiación beta de Sr90 ha sido abandonado, pues daba datos erróneos.

La salida de cada componente separado, al pasar por el detector es registrada mediante un aparato registrador sensible conectado al cromatógrafo, sobre papel graduado, sobre la llamada línea de base que corresponde al pasaje del gas vector puro y en forma de picos que nacen y terminan en esa línea, dependiendo su altura y ancho de base de la cantidad del componente. La medida de la superficie de cada pico, sea por integradores o por triangulación, da una idea cuantitativa de la proporción del componente en la mezcla. Suele facilitarse la apreciación cuantitativa por agregado de una cantidad exacta de una sustancia pura cuya salida no se superponga a la de ninguno de los componentes de la mezcla.

La cantidad de muestra necesaria varía entre fracción de microlitro y unos pocos microlitros, cinco o diez, según la composición del producto y si se desea registrar la presencia de pequeños componentes o tan solo de los principales, o sub productos de un sistema en reacción, etc. La muestra líquida se inyecta a través de un septum en el block de inyección (convenientemente calentado) de donde pasa a la columna cromatográfica, usando generalmente jeringas especiales, Hamilton, graduadas en microlitros o fracción de microlitro y provistas de agujas finas. Es posible, mediante trampas y aplicación de frío, recoger las fracciones que se van separando y pueden usarse para hacer determinaciones físicas o químicas complementarias para facilitar la identificación, como ser los espectros en infrarrojo y en ultravioleta.


ESTUDIO Y CONTRALOR DE PRODUCTOS AROMÁTICOS.

En lo que a los productos aromáticos se refiere, la cromatografía gaseosa está prestando ya importantísimos servicios.

Permite, en primer lugar, convenientemente elegida la fase fija y las condiciones de la cromatografía, obtener el cromatograma típico de cada producto natural, o mezcla artificial determinada; lo que constituye una especie de "tarjeta de identificación" en la que figurarán sus componentes en las proporciones relativas en que se encuentran en el producto.

Cuando algún componente se encuentra en muy pequeña proporción y si la fase fija no es lo suficientemente selectiva al salir puede quedar incluido en el pico de otro componente presente en mayor cantidad, o bien no ser registrado, o solamente como una ondulación de la línea de base. Si se quiere obtener su registro puede, a veces, conseguírsele usando columnas más largas, menos temperatura y menor flujo, para largar el cromatograma; así como máxima sensibilidad, que se reduce cuando salen los grandes componentes; como mayor cantidad de muestra. Las columnas capilares Golay, ya mencionadas, permiten una mayor resolución y registro de pequeños componentes.


N 1 Ac. Es. de Mentha piperita I (5 ml)
N 2 Ac. Es. de Mentha arvensis (Misiones)

Vinculada a la aplicación mencionada, es útil la obtención del cromatograma para estudiar variaciones de composición por efecto de distintos factores como altura, clima, naturaleza del suelo, hibridación de las plantas, etc. También permitirá apreciar la separación de algún componente importante y la adulteración por agregado de otra sustancia extraña al producto genuino.

Permite apreciar si un producto es puro, o mezcla de otros, o si contiene materia prima no transformada, o subproductos de la elaboración, etc.

Permite comparar las esencias de distintas variedades de una misma especie y apreciar las variaciones en la composición sea cuali o cuantitativamente.

Es, asimismo, de gran ayuda en el estudio de la composición de una esencia o producto aromático desconocido; en cuyo caso será necesario para facilitar la identificación de los componentes, disponer de tablas de valores con los tiempos de retención de los componentes usuales en los productos aromáticos, por supuesto para igual fase fija, en la misma proporción sobre igual soporte, iguales dimensiones de columna y condiciones de cromatografía, a saber: gas, presión y flujo y temperatura.

Como puede apreciarse de la enumeración de aplicaciones hecha, ellas son múltiples y muy valiosas en el campo de los productos aromáticos y permiten resolver bien problemas sin solución mediante otras técnicas, o solucionar más rápidamente aquellos, muchas veces con menor cantidad de muestra.



N 3 Mentha pulegium
N 5 Peperina (Minthostachis verticillata.)

1. CROMATOGRAFÍA GASEOSA DE ACEITES ESENCIALES DE MENTA

Nos ocuparemos en primer término de la cromatografTa gaseosa de los aceites esenciales de las diversas especies de menta cultivadas, por ser los de mayor producción en el país.

El estudio experimental que se resume a continuación ha sido realizado en colaboración con el Dr. Teodoro A. A. Manfredini, químico de Palmolive.


A. Cromatogramas tipo o de identificación.

Se ha usado en los estudios realizados un cromatógrafo Perkin Elmer, modelo 154-C y ensayados distintas fases fijas y condiciones de operación, hasta adoptar para estos estudios, las siguientes:

Fase fija: "saib" (diacetatohexaisoburirato de sacarosa) suministrado por "INDARCO S.R.L." al 10 % sobre

Soporte inerte: tierra de diatomeas Hy-Flo, lavada y neutralizada y tamizada por tamiz de malla 80.

Columna: de vidrio, de 1/4 de pulgada de diámetro, en forma de U, usando dos de un metro c/u conectadas en el block del aparato.

Gas: nitrógeno puro y seco; Presión y flujo: de 3 a 4 psi y de 14,5 a 21 ml/min.

Temperatura: 150C.

Muestra: cinco microlitros, inyectados mediante jeringa Hamilton.


N 4 Mentha viridis.

Para referencia en la observación de los cromatogramas se acompaña una tabla con los tiempos de retención de los componentes mayores, en las condiciones antes enumeradas y con flujo de 16,2 ml/min.

Tiempos de retención de componentes de aceites esenciales de menta (columna de saib, de 2 m, a 150C, 3 psi de N2 y 16,2 ml/min.

Componente

Tiempo de retención

1.Limoneno

3,4 - 3,5 minutos

2.Mentona

11,7 minutos

3.Mentol

16,8 - 17,5 minutos

4.Pulegona

20,1 -20,2 minutos

5.Carvona

28,4 minutos

Se acompañan los cromatogramas obtenidos, usando como fase fija "saib", de aceites esenciales de:

  1. Mentha piperita, de producción nacional (Mendoza).
  2. Mentha arvensis, var. piperascens de producción nacional (Misiones).
  3. Mentha pulegium, de origen norteamericano.
  4. Mentha spicata (= M. viridis), de producción nacional.
  5. Minthostachys verticillata ("peperina") de producción nacional (Córdoba).

Comparando estos cromatogramas se puede apreciar la distinta composición, tanto en componentes volátiles (hasta mentona inclusive) y pesados (mentol en adelante). Podría apreciarse el contenido relativo de hidrocarburos y componentes oxigenados, incluyendo mentona y mentol, en los de menta piperita y menta arvensis o japonesa, así como la presencia nítida de la pulegona en los de peperina y poleo (menta poleo, M. pulegium) la de carvona en enorme proporción en el de yerbabuena o Mentha viridis.



N 6 Mezcla de M. piperita 8p y M. pulegium 2p.
N 7 Mezcla de M. pperita 8p y M. viridis 2p.

B. Mezclas y alteraciones.

Se acompañan a este trabajo los cromotogramas obtenidos en iguales condiciones que los anteriores (salvo alguna diferencia en el flujo) de cuatro mezclas:
  1. de ac. es. de M. piperita 8 p. con el de M. pulegium 2 p.;
  2. de ac. es. de M. piperita 8 p. con el de M. viridis 2 p.;
  3. de ac. es. de M. piperita 8 p. con el de "peperina" 2 p. y
  4. de ac. es. de M. arvensis var. piperascens 8 p. con el de "peperina" 2 p.

así, como también el de un aceite de Mentha arvensis o japonesa desmentolado.

Puede apreciarse al observárselos la aparición de nuevos picos en el cromatograma de la menta piperita: de pulegona, con mayor tiempo de retención que el mentol, en las mezclas con aceites esenciales de M. pulegium y "peperina", de carvona, con tiempo de retención aún mayor que la pulegona, en la mezcla con aceite esencial de M. spicata (= M. viridis) o "spearmint". En lo que al de la mezcla de aceites esenciales de M. arvensis var. y "peperina" se refiere, se observa aumento en la proporción relativa de mentona y aparición neta del pico de la pulegona.


N 8 Mezcla de M. piperita 8p y Peperina 2p
N 9 Mezcla de M. arvensis 8p y Peperina 2p.

El cromatograma del aceite esencial de menta japonesa desmentolada, muestra variación en la proporción relativa de sus componentes con disminución del pico del mentol y aumento en el de la mentona e hidrocarburos. Con respecto a los cromatogramas nos parece oportuno mencionar que los picos de mentol, en los de aceites en que es componente principal, o de pulegona en el de poleo y de carvona en el de spearmint, el pico correspondiente es ancho de base y aparece por lo general con la cima horizontal, por límite de registro; en otros cromatogramas se ha modificado ese límite, reduciendo la sensibilidad de registro, con lo que se obtiene, al bajar la línea de trazado, ubicar el pico o cima dentro del pico principal, lo que sirve para poder apreciar mejor la proporción relativa y ubicar el punto máximo de salida para el cálculo del tiempo de retención.

Otra fase fija, usada en un estudio posterior por el autor, ha dado muy buen resultado en las condiciones que se indican a continuación.

La fase fija es el succinato (poliéster) de dietilenoglicol (peso molecular aproximado de 4000) al 10% sobre chromosorb R (columna P de Perkin Elmer) y las condiciones de cromatografía mejores: temperatura 125C, presión 4 psi y flujo 23,7 ml/min; empleando nitrógeno. Se incluye, al final de la serie el cromatograma del aceite esencial de una Mentha piperita de Mendoza y la tabla de tiempos de retención de los picos obtenidos, así como que componente les corresponde.


N 10 M. arvensis desmentolada
N 11 Ac. Es. de Mentha piperita de Mendoza (5 ml).

Cromatograma del aceite esencial de Mentha piperita de Mendoza obtenido usando columna P (polisuccinato de dietileno glicol al 10% sobre chromosorb R) de l/4 pulg x 1 m long.; a 125C y 4 psi (flujo 23,7 ml/min) y gas nitrógeno.

Pico

Tamaño

Tiempo de retención

Componente

1

muy pequeño

0,9 min.

-

2

pequeño

1,3 min.

-

3

mediano

1,7 min.

alfa Pineno

4

muy grande

2,3 min.

Limoneno

5

grande

2,7 min.

Cineol

6

pequeño

3,4 min.

Felandreno

7

mediano

4,8 min.

Terpineno ?

8

med - pequeño

8,4 min.

Mentofurano ?

9

grande

10,1 min.

Mentona

10

grande

13,3 min.

Acetato de mentilo

11

muy grande

18,0 min.

Mentol

12

pequeño

22,8 min.

Piperitona

En lo que a los aceites esenciales de Mentha arvensis se refiere ha sido también posible, aplicándo la cromatografía gaseosa comprobar cambios de la composición en los aceites esenciales de diferentes plantas, debida a alguna modificación aún no registrada botánicamente, provenientes de una plantación experimental de INTA en Castelar, provincia de Bs. Aires. Las variaciones observadas comprendían desde la disminución del contenido en mentol, su componente normal principal, con incremento de la mentona, hasta la total desaparición del mentol, con enorme incremento en mentona, o aparición de pulegona, e incluso de carvona.




   
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